干货|空间转录组测序实验踩坑心得
空间转录组测序实验流程
图 10X Genomics Visium实验流程
每个实验步骤所需要注意的事项
1、新鲜组织样本包埋
目前新鲜组织的包埋方法有两种，一种是液氮+异戊烷法；另一种的干冰法。对于临床手术切下来的组织样本一般使用干冰的包埋方法。对于穿刺样本等一些较小，较轻的样本，一般推荐用液氮+异戊烷的方法进行冷冻。OCT包埋组织块可以在–80ºC的密封容器中长期保存，或立即进行冷冻切片。
2、冷冻切片切、组织样本质控及贴片
由于空间转录组检测的是组织中的RNA，因此要对切片中的RNA质量进行检测。我们一般取10片组织切片进行RNA抽提并质检，确定组织中RNA完整性（RIN＞7）。所以要求我们的组织样本要保证可以切到至少20片10um厚度的切片，以便完成所有的实验。
3、组织优化
组织优化的目的是摸索样本的最佳透化条件，保证组织切片中的mRNA能够充分释放。该步骤是获取真实实验结果的必要条件。否则，我们无法判断是基因表达高低到底是因为透化不充分导致的，还是实际就是这个样子。因此：每个样本建议都要做透化，尤其是临床样本。
4、成像
应使用Visium Imaging Test Slide验证成像设置。明场成像基准框和基准标记应清晰可见，并使用Brightfeld设置聚焦。Visium Imaging Test Slide四个区域（A1，B2，C1，D2）具有荧光斑点，可通过TRITC和Cy5 flter cubes检测到，荧光设置应清晰可见A1，B2，C1和D2中的荧光点，且荧光点信号应从左到右减小。
5、正式实验
正式实验时要对反转录后的cDNA长度分布，浓度和量进行判断。cDNA的长度分布在~200bp-9000bp之间，在1000bp左右会有峰值（不同的组织类型会有些许差异）。
6、测序
在捕获区域，每个组织覆盖的spot建议至少测50000 read pairs。整个捕获区域共有5000个spots。可以根据组织贴到芯片上后，覆盖芯片的大小来判断测序的数据量。
计算公式(Coverage Area x total spots on the Capture Area)x 50,000 read pairs/spot 例如：组织覆盖了60%的区域，则数据量为(0.60 x 5,000 total spots) x 50,000 read pairs/spot=150 million read pairs。
图 切片覆盖芯片区域百分比
详情咨询：17702139967
邮箱：Market@shbio.com
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