单细胞项目文章登《PNAS》|陈赛娟院士团队发表了肝细胞异质性决定AAV/CRISPR输注后编辑的F9等位基因的表达等研究成果

2021年10月，陈赛娟院士团队发表了题为“Inherent hepatocytic heterogeneity determines expression and retention of edited F9 alleles post-AAV/CRISPR infusion”影响因子为11.205的研究论文。（单细胞测序服务由伯豪提供）

血友病B（Hemophilia B，HB）是位于X染色体上编码凝血因子IX（FIX）的基因发生突变导致凝血障碍的单基因遗传性疾病。当前最有潜力治疗血友病B的策略之一是基因治疗，特别是免疫原性低且具有组织靶向特异性的单链DNA非整合型病毒-腺相关病毒载体（Adeno-associated virus，AAV）的广泛应用，为血友病治疗带来新模式。近年来以AAV为载体，利用CRISPR/Cas9核酸酶介导的同源重组对突变的FIX基因进行基因编辑，从而治疗血友病B等相关研究成为热点。然而目前相关研究仅靶向FIX基因表达框突变的HB疾病模型，而对于重型HB患者中有部分基因突变是涉及到调控区域的大片段缺失的突变类型，迄今尚未有相关报道。同时，目前对于AAV/Crispr引起的组织炎症反应如何影响基因编辑后蛋白的表达尚未有深入研究报道。

本研究以携带调控区域突变的F9基因所致的重型小鼠血友病B小鼠为模型，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术以AAV载体靶向肝脏细胞直接对调控区域进行体内原位修复，恢复F9基因表达框架。考虑到不同的基因修复方式和调控序列均可影响基因修复后蛋白表达效率，为了获得最佳方案，研究人员设计了3种不同的同源重组（HDR）修复方式，包括单位点介导的定点插入和大片段置换，以及双位点介导的大片段置换等方式，分别联合2种不同的调控序列，即野生型F9基因调控序列（P1）和具有较强驱动能力的人工合成的白蛋白来源的肝脏特异性调控序列（P2）。通过对6种方案有效性的比较最终筛选出FIX蛋白水平最高的方案，即在P2调控下通过单位点置换突变片段的方案可使HB小鼠血浆中FIX活性达到临床治疗水平。通过深度测序、液相芯片检测等检测结果表明该策略的脱靶效应较小，肝功能损伤具有自限性，具有良好的生物安全性。同时，研究人员发现注射AAV载体后小鼠肝脏早期即可出现亚临床炎症反应，研究人员用地塞米松对注射AAV/Crispr治疗后的HB小鼠行抗炎治疗，发现FIX蛋白水平可上升至之前的3-4倍。通过scRNA-seq及各种生物信息学分析，研究进一步阐明输注AAV/Crispr后引起的亚临床肝脏炎症可通过调节特定肝脏细胞亚群的肝脏富集转录因子（LETFs）和肝脏内各类免疫细胞的相互作用以及CD8+细胞毒性T淋巴细胞对AAV感染的宿主细胞的清除等机制影响FIX蛋白的表达。

为了了解其潜在的机制，研究人员对注射了scRNA-seq的HB小鼠的肝细胞进行了单细胞测序等检测，分别为PBS组(H1组)、双AAV不加DXM处理组(H2组)、双AAV加DXM处理组(D组)(每组n = 3只，共23只)。将scRNA-seq数据与bulk RNA-seq数据进行比较，发现H1组(r = 0.64)和H2组(r = 0.66)存在显著相关性。确定了统一流形近似和投影(UMAP)可视化通过对差异表达基因进行分类，从所有单细胞中分离出16个细胞簇(C0-C15)，包括两个肝细胞亚群(主要的C3和次要的C10)和多种类型的造血谱系。

不同簇间的F9投影UMAP图显示F9 mrna阳性细胞位于C3肝细胞亚群。与H2组相比，D组C3细胞中F9 mrna阳性(C3F9+)率预期增加，但F9 mRNA的平均水平增加，C3F9+细胞无统计学意义。同时，肝细胞中mF9拷贝(HDR + 1/2 site 2 HITI)功能编辑的平均频率增加。考虑到C3肝细胞只占肝细胞的一小部分， C3FEs的平均比率可能远高于实际的C3F9+比率。因此，部分C3FEs可能表现为C3F9−表型，这可能是由于P2活性受到抑制。正如预期的那样，AAV灌注增强了C3肝细胞的炎症状态，同时损害了肝功能(SI)。矛盾的是，C3F9+部分的炎症特征较弱，但功能较好，C3F9−H2条件下的肝细胞。C3F9+细胞与白化C3肝细胞高度重叠表明肝脏功能良好。

这些观察表明，部分C3FEs中的P2活性被宿主细胞较高的炎症状态所关闭，而这种状态被逆转DXM。同样，与未处理的H1:C3F9−细胞相比H2:C3F9−细胞，而H2:C3F9+细胞P53信号通路和凋亡通路增强，DXM可改善这一现象。鉴于肝细胞在功能和炎症状态方面具有高度异质性，这些观察表明C3FEs对它们的存活和P2活性有负面影响。为了探索固有的肝脏异质性如何调节p2驱动的F9表达，研究人员进一步通过UMAP将C3肝细胞以更高分辨率分为5个亚组(HC0-HC4)。假时间分析表明，HC0、HC1和HC2亚群在发育过程中更密切相关，它们构成H1、H2和D条件下C3肝细胞的主要组分。实际上，次要的HC3和H1或H2条件下的HC4亚群在D条件下很难检测到。有趣的是，在H2和D条件下，单个HC0-HC3亚群之间的F9+细胞率与alhi细胞率平行，证实了P2活性与Alb mRNA水平之间的紧密联系。此外，注射AAV/CRISPR后，在HC0 - HC2亚群中Alb表达下调，而在HC3亚群中Alb表达上调。因此，炎症会根据宿主细胞类型上调或下调P2活性或Alb表达。

本研究提供了一个AAV/Crispr介导的、适用血友病B和其它肝脏单基因遗传疾病、及肝细胞基因重组性修饰的一般性治疗策略，并深入探讨了基因治疗触发炎症对基因治疗效果的潜在影响，为优化血友病等单基因遗传病的基因治疗提供了实验研究基础。

参考文献：

Wang Q, Zhang L, Zhang GW, Mao JH, Xi XD, Jiang L, Lv G, Lu J, Shen Y, Chen Z, Zhu J, Chen SJ. Inherent hepatocytic heterogeneity determines expression and retention of edited F9 alleles post-AAV/CRISPR infusion. Proc Natl Acad Sci U S A. 2021 Oct 19;118(42):e2110887118. doi: 10.1073/pnas.2110887118. PMID: 34649996.

关于伯豪生物

上海伯豪生物技术有限公司（www.shbio.com）是生物芯片上海国家工程研究中心的有机组成部分，专注于提供领先的生物医药和疾病诊断技术创新、产品及优质服务。从事技术服务18年，承接项目超过10000个，服务过超3000家科研高校和医院，企业客户。公司拥有40多项发明专利和软件著作权。已经成功研发20余种试剂产品，进入市场销售。协助客户发表SCI论文2000余篇，总影响因子超10000分。

企业文化

企业愿景：成为卓越的生命奥秘探索者

企业使命：服务科技创新，护航人类健康 

企业价值观：创新、诚信、专注、合作、共赢

推荐阅读

END

本文为伯豪生物原创

欢迎转发朋友圈

转载请注明来自伯豪生物

更多精彩内容“阅读原文”

据说，点了 三连 的人都是科研达人噢！