JITC-联合全局和靶向蛋白组学揭示转移性皮肤黑色素瘤患者血浆蛋白与抗PD-1免疫治疗之间的新关联

为发现血浆中与免疫抑制剂治疗相关的系统性变化，并寻找与治疗结果相关的潜在生物标志物，瑞典卡罗琳斯卡医学院 (Karolinska Institute) 的研究人员借助基于Olink的靶向蛋白质组学（Olink I/O Panel）及其他方法分析了24名CM患者的连续血浆样本，并同时分析了24名接受MAPKis治疗CM患者的血浆蛋白组以确定ICI治疗的特异性血浆蛋白水平的变化；相关结果发表在JITC上。

概述:  

免疫检查点抑制剂（Immune checkpoint inhibitors, ICIs）疗法，如细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4（CTLA-4）和程序性细胞死亡蛋白1（PD-1）抑制剂，已经显著改善了转移性皮肤黑色素瘤（metastatic cutaneous melanoma, CM）患者的治疗效果。根据III期临床试验的长期随访，PD-1抑制剂如帕博利珠单抗（Pembrolizumab-默沙东公司的KEYTRUDA）、纳武单抗（Nivoluma-百时美施贵宝公司的 OPDIVO）与CTLA-4抑制剂伊匹单抗（Ipilimumab -百时美施贵宝公司的YERVOY）相比，显示出一定优越性。除了ICIs，携带BRAFv600突变的转移性皮肤黑色素瘤患者还有另一个治疗选择，即对丝裂原激活蛋白激酶抑制剂（MAPKis）的靶向治疗，包括BRAF抑制剂和MEK抑制剂（BRAFis/MEKis）。

同时，仍然有相当部分的CM患者对ICI治疗无应答或产生耐药性，即使是抗PD-1和抗CTLA-4联合治疗也有约40%的无应答率。虽然有预测治疗反应的需要，但到目前为止，临床实践中尚缺乏有效的生物标志物用于预测CM患者的抗PD-1治疗效果。通过液体活检方法获得的越来越多的证据表明，在CM疾病中不同亚克隆之间的高度异质性对治疗的应答以及对治疗的耐药性的发展均有影响。

为发现血浆中与治疗相关的系统性变化，并寻找与治疗结果相关的潜在生物标志物，瑞典卡罗琳斯卡医学院 (Karolinska Institute) 的研究人员利用基于质谱的全局蛋白组学（高分辨率等电聚焦液相色谱-质谱，HiRIEF LC-MS/MS）和基于Olink的靶向蛋白质组学（Olink 免疫-肿瘤Panel）分析了24名CM患者的连续血浆样本，并同时分析了24名接受MAPKis治疗CM患者的血浆蛋白组以确定ICI治疗的特异性血浆蛋白水平的变化。

结果显示了在抗PD-1治疗期间循环PD-1的增加，以及在抗PD-1应答者中多样化的免疫血浆蛋白组学标志。这项研究展示了血浆蛋白组学作为液体活检方法的潜力，以及在发现CM患者抗PD-1治疗的预测性生物标志物方面的价值。该项题为《In-depth plasma proteomics reveals increase in circulating PD-1 during anti-PD-1 immunotherapy in patients with metastatic cutaneous melanoma》的研究发表在学术期刊《Journal for ImmunoTherapy of Cancer》（IF：10.2）上。

研究方案：

实验设计和检测方法：

采用靶向蛋白组学工具，在研究队列中使用ICI或对比队列中使用MAPKis治疗期间，在基线和治疗前收集血浆样本。对治疗结果进行前瞻性跟踪。

基于邻近延伸检测（Olink PEA），使用Olink Immuno-Oncology I panel进行测量，总共有92个蛋白生物标志物。

基于质谱的蛋白组学分析：高分辨率等电聚焦液相色谱-质谱（HiRIEF LC-MS/MS）。

CR，完全反应；ICIs，免疫检查点抑制剂；log2-FC，log2-fold-change；NR，无反应；PR，部分反应；pre-trm，治疗前；SD，稳定疾病；trm，第一个治疗周期后；PEA，Olink邻近延伸反应。

患者特征和血浆样本：

在治疗前(pretrm)和第一个治疗周期(trm)后、第二个周期前，从接受一线ICI(即抗CTLA-4和/或抗PD-1)或MAPKis(MEKis和/或BRAFis)治疗的转移性(IV期)CM患者中收集了连续的血浆样本。样本之间的中位数为20天（范围：7-57，SD：10.26）。

对治疗的最佳反应基于临床和/或放射学调查（即CT、MRI和/或正电子发射CT断层扫描），由肿瘤学家和放射学家评估。应答者被定义为完全反应（CR）或疾病稳定（SD）或部分反应（PR）（即现有转移灶的数量和/或大小减少）的患者，没有出现经影像学和/或临床检查证实的新病灶。非应答者被定义为病灶增大或经影像学和/或临床检查显示的新病灶，而之前对治疗没有任何反应的患者。

结果解析：

蛋白血浆水平的变化与抗PD-1治疗有关

总体而言，HiRIEF LC-MS/MS检测到1835种蛋白质，其中的1160个至少有50%的观察值。在接受抗PD-1治疗的患者中，80种蛋白在治疗期间的血浆水平有显著变化。

相比之下，Olink panel中的92个免疫肿瘤相关蛋白有77个具有至少80%的观察值，其中的23种蛋白在抗PD-1治疗期间的血浆水平发生了显著变化。

HiRIEF LC-MS/MS检测到Olink panel 92个蛋白中的10个（10.87%）：PD-1、PDCD1LG2/PD-L2、TNFRSF21、CSF1、TGFB1、TEK、DCN、LGALS1、KDR和 ICOSLG；其他82个蛋白（89.23%）未能检出。

转移性皮肤黑色素瘤抗PD-1治疗期间蛋白血浆水平的变化，以火山图比较所有接受抗PD-1 ICI治疗的匹配样本患者在第一个治疗周期后与治疗前的蛋白血浆水平。(A) HiRIEF LC-MS/MS 分析 (paired t test, two sided). 虚线以上的蛋白=p<0.05，红色和虚线以上的蛋白=p<0.001（无FDR）。(B) PEA分析（paired t test, two sided）。虚线以上的蛋白=q<0.1，红色和虚线以上的蛋白=q<0.05（p<0.05，10%FDR）

抗PD-1治疗应答者的血浆蛋白组标志

根据最佳反应对患者进行分层，显示在HiRIEF数据中的抗PD-1-R亚组中，84种蛋白在治疗期间血浆水平发生了改变（P<0.05，无FDR），其中PD-1的增幅最大。

而PEA分析显示36种蛋白在治疗期间抗PD-1-R亚组有显著变化(p<0.05，10% FDR)，其中22种是抗PD-1-R亚组的特异性蛋白--其中包括PD-1、IL-6和IL-10--再次显示了全局分析检测到的PD-1的显著变化。

对转移性皮肤黑色素瘤抗PD-1治疗反应的分层分析。(A)HiRIEF LC-MS/MS热图，抗PD-1-R亚组治疗期间血浆蛋白水平有统计学显著变化的蛋白，抗PD-1-NR和使用MAPKis治疗的患者治疗期间有相应的变化。(B)根据Olink PEA数据绘制的抗PD-1-R治疗过程中蛋白血浆水平统计学显著变化热图，抗PD-1-NR和MAPKis治疗的患者在治疗过程中也有相应变化。

总体上，在抗PD-1-R的治疗过程中，根据相应的生物过程的GO术语，检测到在血浆中发生变化的大部分蛋白参与T细胞反应、炎症、中性粒细胞脱颗粒和细胞粘附。在治疗过程中，几种急性期蛋白的水平都有增加，其中包括C反应蛋白（CRP）、脂多糖结合蛋白（LBP）、aptoglobin（HP）和IL-6，表明抗PD-1-R的急性炎症正在进行中。还检测到血浆中参与构建细胞和细胞外基质之间相互作用的细胞粘附蛋白（如SDC1、ITGB6和ITGB2）的水平增加。

蛋白质血浆水平可以预测无进展生存期PFS

蛋白质血浆水平与无进展生存期(PFS)之间关系的森林图（Cox模型）

HiRIEF数据仅包括抗PD-1治疗的患者，而PEA数据包括接受抗PD-1和/或抗CTLA-4治疗的患者。

在HiRIEF LC-MS/MS分析的抗PD-1治疗队列亚组（n=13）中，没有临床变量与PFS相关。在抗PD-1和MAPKi队列中，没有检测到与PFS相关的蛋白治疗前水平的重叠。图A绘制了基于HR估计的与PFS关联性最强的蛋白质。

通过对Olink PEA数据的单变量分析，检测到ICI队列中25种PEA蛋白的较高血浆水平与较短PFS之间的关联（P<0.05，10%FDR；图B）。在PEA数据中，年龄和性别是与PFS显著相关的临床变量，有7个蛋白在多变量分析中对预测较短的PFS也仍然显著(p<0.05，10% FDR；图C)。调整年龄和性别后，在ICI队列中用Olink分析的9种蛋白的血浆水平的增加与更长的PFS相关（P<0.05，10%FDR；图E）。

结论：

此项研究是首次对接受ICI治疗的转移性皮肤黑色素瘤患者的血浆蛋白组进行的全面研究，为了解治疗过程中循环蛋白的变化提供了独特的见解。虽然样本量有限，但研究设计和分析方法能够确定血浆中抗PD-1治疗的特异性分子变化；同时，这项研究也侧面展示了基于PEA的Olink panel，在检测血浆蛋白组中的灵敏度较高的特点。

这项研究展示了抗PD-1治疗期间转移性CM患者血浆中循环PD-1和PD-L1水平的增加，以及多样化的免疫血浆蛋白组学标志，这需要在独立的更大队列中用靶向方法进行验证。此外，联合全局和靶向蛋白质组学显示了转移性CM患者血浆蛋白和抗PD-1治疗结果之间的新关联，以及在揭示治疗过程中的系统生物学过程方面的潜力。考虑到肿瘤的分子异质性和归因于ICI治疗的系统性分子过程，参与不同免疫相关和肿瘤衍生过程的多样化血浆蛋白组学标志物很可能提供更可靠的治疗预测。

Reference: Babačić H,et al. In-depth plasma proteomics reveals increase in circulating PD-1 during anti-PD-1 immunotherapy in patients with metastatic cutaneous melanoma. J Immunother Cancer. 2020. 8:e000204. doi: 10.1136/jitc-2019-000204. https://jitc.bmj.com/content/8/1/e000204

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