单细胞测序｜抗PD1治疗期间乳腺癌患者肿瘤变化的单细胞图谱
标题：A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer
乳腺癌患者抗PD1治疗期间肿瘤内变化的单细胞图谱
期刊: Nat Med
影响因子：36.13
导读
免疫检查点阻断(ICB)联合新辅助化疗可改善乳腺癌的病理完全缓解率。激素受体阳性或三阴性乳腺癌患者术前均进行抗PD1治疗，为了了解为什么只有一部分肿瘤对ICB有反应，本研究对接受抗PD1治疗的初治疗患者(n = 29)或在抗PD1治疗前接受新辅助化疗的患者(n = 11)的配对治疗前和治疗中活检进行单细胞转录组、T细胞受体和蛋白质组分析。三分之一的肿瘤含有表达PD1的T细胞，无论肿瘤亚型如何，这些T细胞在抗PD1治疗后可以克隆扩增。扩增主要涉及明显表达细胞毒性(PRF1, GZMB)、免疫细胞归巢(CXCL13)和衰竭标志物(HAVCR2, LAG3)的CD8 T细胞，以及表达T-helper-1 (IFNG)和滤泡helper (BCL6, CXCR5)标志物的CD4 T细胞。在治疗前的活检中，免疫调节树突状细胞(PD-L1)、特异性巨噬细胞表型(CCR2或MMP9)和表现出主要组织相容性复合体I/II类表达的癌细胞的相对频率与T细胞扩增呈正相关。相反，未分化的预效应/记忆T细胞(TCF7, GZMK)或抑制性巨噬细胞(CX3CR1, C3)与T细胞增殖呈负相关。总的来说，我们的数据确定了抗PD1治疗后与T细胞扩增呈正相关或负相关的各种免疫表型和相关基因集，阐明了乳腺癌中抗PD1治疗反应的异质性。
科学问题
激素受体阳性或三阴性乳腺癌患者术前均进行抗PD1治疗，以期进一步确认为什么只有一部分肿瘤对ICB有反应？哪些潜在机制和相关标记决定治疗反应。
实验设计
对接受抗PD1治疗的初治疗患者(n = 29)或在抗PD1治疗前接受新辅助化疗的患者(n = 11)的配对治疗前和治疗中活检进行单细胞转录组、T细胞受体和蛋白质组分析。
实验思路
实验结果
⚫ 抗PD1治疗前和治疗期间的单细胞分析。
对接受抗PD1治疗的初治疗患者(n = 29)或在抗PD1治疗前接受新辅助化疗的患者(n = 11)，活检后进行单细胞测序。分析设计175942个细胞，平均每个细胞检测到1759个基因，可归属于恶性乳腺上皮细胞、免疫细胞、内皮细胞和成纤维细胞(图1b)。
⚫ 不同免疫细胞在免疫治疗中的分化规律
作者通过对比治疗前后出现T细胞克隆增殖（Es）和未出现克隆增殖（NEs）病人体内免疫微环境的改变，挖掘其中可能存在的细胞分化和免疫机制。研究发现，表达PD-1的CD4+和CD8+ T细胞亚型是抗PD-1治疗的主要靶点细胞。通过拟时序分析，作者观察到CD8+ Tex细胞有三种不同的细胞分化轨迹，并且抗PD-1诱导的T细胞在持续扩增。辅助性CD4+ T 细胞（TH1、TFH）的细胞轨迹表明该细胞在很大程度上促进了克隆性的扩增，这也表明它们支持并辅佐CD8+ Tex细胞的持续效应功能。这两类主要靶点细胞所对应谱系的分化程度和克隆增殖情况可以用来预测PD-1治疗后发生的反应，且PD-1治疗可能会进一步促进此类细胞的分化。
T细胞/自然杀伤(NK)细胞亚群的14种表型
CD8+ T细胞拟时序图
CD4+ T细胞拟时序图
⚫ 树突状细胞及巨噬细胞与T细胞扩增的相关性
树突状细胞(DCs)在调节CD8+ T细胞免疫和肿瘤抗原耐受之间的平衡中起着核心作用。对树突状细胞(DCs)进行细胞亚型注释，得到6个抗-PD1表型（如图所示）。进行免疫组化分析得出，CXCL9和CXCL10是T细胞向肿瘤迁移的重要因素，且与免疫应答和抗原呈递相关的基因在治疗时均表达升高。考虑到巨噬细胞也作为肿瘤免疫的中介，作者又将7952个髓系细胞分为10个表型（如图所示）。与树突状细胞相似，巨噬细胞也表达PD-L1和PD-L2，在亚簇水平上大多数巨噬细胞表型表达PD-L1。通过CITE-seq的分析可知，CCR2+或 MMP9+ 等巨噬细胞和多种树突状细胞亚型均与治疗反应呈正相关，而CX3CR1+巨噬细胞的比例与T细胞的克隆增殖呈负相关。该研究进一步发现了乳腺癌中表达PD-L1的主要细胞类型并不是肿瘤细胞而是巨噬细胞和树突状细胞，而后两者PD-L1的高表达可以预测免疫治疗反应。
树突状细胞(DCs)细胞亚型注释
巨噬细胞亚型注释
⚫ 与T细胞扩增相关的免疫环境
作者还探讨了细胞类型和表型预处理与T细胞扩增的相关性。CD4+或CD8+ Tex细胞、增殖T细胞、migDC(迁移性DC)、表达PD-L1的巨噬细胞表型(包括CCR2+和MMP9+巨噬细胞)的相对频率与T细胞的扩增呈正相关，而幼稚或效应/记忆T细胞与抑制性(CX3CR1+)巨噬细胞与T细胞的扩增呈负相关。这些数据均描述了治疗前活检中与抗PD1治疗后T细胞扩增相关的免疫环境。
扩增的T细胞克隆型数（左），细胞类型或细胞表型的相对丰度（右）
该研究通过对免疫治疗前后10天左右的肿瘤微环境改变的初期特征进行了分析研究，对临床实践具有重大指导意义。
参考文献：
Bassez A, Vos H, Van Dyck L, Floris G, Arijs I, Desmedt C, Boeckx B, Vanden Bempt M, Nevelsteen I, Lambein K, Punie K, Neven P, Garg AD, Wildiers H, Qian J, Smeets A, Lambrechts D. A single-cell map of intratumoral changes during anti-PD1 treatment of patients with breast cancer. Nat Med. 2021 May;27(5):820-832. doi: 10.1038/s41591-021-01323-8. Epub 2021 May 6. PMID: 33958794.
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