文献解读|基于单细胞测序探究溶瘤病毒对B细胞淋巴瘤的治疗效果

标题：Oncolytic virotherapy-mediated anti-tumor response: a single-cell perspective

期刊： Cancer Cell

影响因子：31.74

导读

在非黑色素瘤皮肤癌症中（NMSC），pCBCL是一组限定在原发于皮肤的淋巴结外非霍奇金淋巴瘤，其主要类型有：惰性原发性皮肤滤泡中心淋巴瘤（primary cutaneous follicle center lymphoma，pCFCL），原发性皮肤边缘区淋巴瘤（primary cutaneous marginal zone lymphoma，pCMZL），更具侵袭性的原发性弥漫大B细胞淋巴瘤，发生于腿部（primary diffuse large B cell lymphoma, leg type，pCDLBCL, LT）。Talimogene laherparepvec (T-VEC)是一种被批准用于癌症治疗的转基因单纯疱疹病毒(HSV-1)，在本文中，实验人员着手验证其对于B细胞淋巴瘤的治疗效果。单细胞测序技术可以帮助我们捕捉到在受到病毒入侵后免疫细胞会做出怎样反应的细节信息。因此在实验中，实验人员使用重复细针穿刺(FNAs)对注射和非注射原发性皮肤B细胞淋巴瘤（primary cutaneous B cell lymphoma，pCBCL）病灶在临床、组织学、单细胞转录组和免疫系统水平上探究该病毒的效果。对FNAs采集的样品进行单细胞测序，研究人员确定了恶性细胞群，并分离出三种pCBCL亚型。注射24小时后，实验人员在注射后病灶的恶性和非恶性细胞中检测到HSV-1T-VEC转录本，但在非注射病灶中检测不到。实验结果表明，溶瘤病毒治疗能迅速根除恶性细胞。它还能引起干扰素途径激活和自然杀伤细胞、单核细胞和树突状细胞的早期汇集。在这些事件发生后注射和非注射病灶中细胞毒性T细胞富集，调节性T细胞减少。

科学问题

使用溶瘤病毒后肿瘤免疫微环境会有着怎样的变化？

实验设计

测序样本为来自受试者的每人大约5000个细胞

技术平台

10X genomics

⚫ 用单细胞RNA测序技术捕获T-VEC介导的响应

实验人员对三名患有皮肤淋巴癌不同亚型的患者在91天的治疗过程中进行采样和测序。与基准值相比，在对病灶注射后所有患者的B细胞数量下降。在治疗的最后，这一下降极为显著。此外，NK细胞，单核细胞，CD4+和 CD8+ T细胞数量显著上升。在所有类型的病灶中细胞类型组成的改变程度在最初的5周之内逐渐增加，之后趋于平稳。在p7和p11两位病人的病灶中，主要细胞成分的改变在最初的两次采样中就已经发生（图1B，C）。由于在最初的5周内病灶肿瘤微环境会经历最大的改变，实验人员需要对这段时间内的患者病灶进行多次采样。

图1 T-VEC注射后临床、组织学和细胞类型组成的变化

⚫ 恶性标记物证实以bcr为基础的恶性B细胞群

基于基因表达的不同，B细胞分出了几个不同的类别（图2A）。病患中最常出现的B细胞类群pCFCL与pCMZL聚类结果表现为接近，而距离更有侵袭性的亚型（pCDLBCL, LT）较远（图2B）。此外，增殖标志物 PCNA(proliferating cell nuclear antigen)的表达上调以及B细胞上已知的恶性肿瘤标志物的存在证实了这些细胞是恶性肿瘤。

图2 恶性细胞聚类

⚫ T-VEC的进入和复制并不局限于恶性B细胞群

免疫组化的实验结果表明在注射T-VEC14天后病毒全部消失，或者是数量下降到检测范围之外。因此实验人员想要用单细胞测序技术探究注射后病毒的转录表达情况。在注射病毒之后，病毒的读长计数会在第七天极大地下降，在第14天下降到检测范围之外。这一动态过程在随后的注射中会重复上演，但每次转录物的表达都会下降（图3A）。在第一天，HSV-1^T-VEC于注射后的病灶中所有检测到的细胞类型中表达（图3B），在所有细胞类型中也检测到了相似的HSV-1^T-VEC感染水平。为了检测HSV-1^T-VEC在进入细胞后是否进一步增殖，实验人员对病毒复制晚期相关基因的表达量进行分析。在第一天，样本中所有细胞均能检测出数量相似的真正晚期转录，表明病毒的复制不受细胞类型限制（图3D）。综上，该实验发现不同于以往的报导，T-VEC入侵细胞不受细胞类型的限制并在恶性与非恶性细胞中有着相似数量的转录表达。

图3 T-VEC的转录物表达

⚫ T-VEC诱导先天和适应性免疫反应的局部和远端变化

基因集富集分析和通路分析揭示出了几个显著上调和下调的通路，上调通路如IFN-α/β信号通路，下调通路有PD-1信号通路、B细胞相关通路等（图4A）。与未注射病灶相比，注射后的病灶免疫细胞中IFN-α/β通路基因表达的差异最大。在注射T-VEC后的第一天，恶性B细胞数量的减少已经很明显，在pCFCL的注射病灶和非注射病灶中，到第7天恶性B细胞数量大量减少（图4B）。恶性B细胞数量的改变与细胞组分的改变相似，其数量的锐减伴随着NK细胞，树突细胞和单核细胞数量的增加，以及T细胞相对比例的逐渐上升（图6B）。在注射病灶中CD8⁺细胞毒性T细胞数量更多，而未注射病灶中CD4⁺T细胞数量更多。在注射与未注射病灶中标志着NK细胞，经典树突细胞，浆样树突细胞单核细胞和巨噬细胞的转录表达上升。纵观整个疗程，所有这些细胞类群中均展现出活化标志物（GO单元）的持续性表达上调，在注射与非注射病灶中观察到相似的改变。在首次病毒注射后的所有时间节点中，NK细胞介导的细胞毒性（GO单元）以及死亡受体通路成员FAS配体（FASL）表达上调，这一现象在注射后与未注射的病灶广泛的NK细胞中均被探测到。在注射的病灶中FAS的表达在第一天达到顶峰，这主要发生在恶性细胞群体（图4C）与T细胞中，这说明活化的NK细胞有可能在杀伤肿瘤细胞。尽管在未注射病灶中恶性肿瘤细胞数量也有所减少，死亡诱导信号复合通路的上调并不明显，说明在注射与未注射病灶中细胞死亡的机制并不相同。CD8⁺T 细胞的数量在治疗开始后第一周内上涨，随后维持在相似的水平，且它的克隆数量多于CD4⁺T细胞（图4D）。在整个疗程中CD8⁺T细胞群体中包含多种TCR克隆型复制的细胞，维持着其丰度。相较于非克隆的CD8⁺T细胞，克隆的CD8⁺T细胞表达较高的细胞毒效应分子(颗粒酶 A [GZMA], 颗粒酶B [GZMB], 穿孔蛋白 [PRF1], 和颗粒裂解肽 [GNLY])（图6E）。表明它们通过抗原表位靶向和克隆扩增对肿瘤清除的重要性。实验也同时观察到调节性T细胞(Treg)对CD8⁺T细胞比率的下降

图4注射和非注射病灶的干扰素信号

参考文献

[1]. Ramelyte E, Tastanova A, Balázs Z, Ignatova D, Turko P, Menzel U, Guenova E, Beisel C, Krauthammer M, Levesque MP, Dummer R. Oncolytic virotherapy-mediated anti-tumor response: a single-cell perspective. Cancer Cell. 2021 Mar 8;39(3):394-406.e4. doi: 10.1016/j.ccell.2020.12.022. Epub 2021 Jan 21. PMID: 33482123.

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