空转实验文章NC-上海免疫所苏冰/叶幼琼团队揭示结直肠癌肿瘤边界间质细胞与巨噬细胞互作模式
前言
结直肠癌(CRC)作为世界上第三大常见恶性肿瘤，每年造成约80万人死亡。最近，对于T细胞有效的抗肿瘤免疫治疗已经有很多研究。然而，PD-1靶向抗体pembrolizumab仅对高微卫星不稳定性的错配修复缺陷肿瘤有效，而这类肿瘤仅仅只占转移性CRC病例的5%。因此，有必要了解CRC肿瘤微环境中细胞和分子重构的机制，进而寻找潜在的干预靶点，以提高免疫治疗的疗效。
本研究作者通过单细胞测序技术联合空间转录组学技术，发现，肿瘤特异性FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞在14个独立CRC队列中(包含2550个样本)呈正相关。此外，通过空间转录组学进一步验证了它们的密切共定位。这种相互作用可能受到趋化素、TGF-β和白细胞介素-1的调控，而且可以刺激免疫排斥的结缔组织结构的形成，限制T细胞浸润。此外，作者还发现FAP或SPP1高表达的患者在抗PD-L1治疗队列中获得的治疗效益较少。该结果为CRC的治疗提供了一种潜在的新的策略。
研究路线
样本类型：5例非转移CRC病人的癌组织和癌旁组织，包括2例结肠腺癌(COAD)，3例直肠腺癌（READ）
技术：单细胞测序，空间转录组测序
主要结果
◾ 细胞类型的划分和注释
5名患者共检测到了54,103个细胞转录组，其中29,481个细胞来自邻近的非恶性组织，24,622个细胞来自肿瘤组织(图1b)。共分为9种主要的细胞类型，包括表达EPCAM和CDH1的上皮细胞(n=8940)，表达T细胞受体(TCR)信号媒介CD3E和CD3G的T/ILCs细胞(n=17420)，表达MS4A1和CD79A的B细胞(n=2998)，表达SDC1和MZB1的浆细胞(n=7252)，CD14和FCGR3A阳性的髓系细胞(n=4617)，表达经典标记物KIT、IL1RL1和MS4A2定义的肥大细胞(n=2781)，内皮细胞(ECs;n=2205)，间充质间质细胞(MSCs;n=7451)，神经胶质细胞(n=439)。虽然这5例患者的肿瘤和癌旁正常组织中均出现了9种主要细胞类型，但每种主要细胞类型的浸润程度不同，这可能反映了CRC进展阶段的差异。
◾ CRC患者肿瘤组织中细胞群的特征揭示了TME的标志性特征和临床结果的预测
为了研究肿瘤浸润的细胞群的调控网络，作者通过MsigDB数据库中的hallmarker基因集来分析相邻正常和肿瘤组织间的MSCs、ECs、胶质细胞、髓系细胞、T细胞和B细胞通路的改变。研究发现，免疫相关通路包括炎症反应、IL2/STAT5信号转导、IL6/JAK/STAT3信号不仅在免疫细胞群中富集，而且与正常组织相比，肿瘤中的MSCs和ECs中也得到了富集，表明MSCs和ECs参与了对抗结直肠癌的免疫应答。
此外，作者还通过CIBERSORTx去进一步分析每种细胞类型的含量，并进一步基于成对斯皮尔曼相关性分析，发现间充质间质细胞和髓系细胞具有显著的正相关性。基于TCGA大数据分析，作者发现，间充质间质细胞和髓系细胞浸润程度越高，病人的预后越差。
◾ 肿瘤特异性FAP+成纤维细胞与结直肠癌进展相关
长期以来，MSC和成纤维细胞样细胞被认为是调节肿瘤发生和癌症进展的关键基质细胞类型。作者利用先前报道的特定细胞特征标记基因将MSCs聚为10个亚型，其中包括FAP+(典型CAF激活标记物)成纤维细胞。通过公共数据库，作者进一步验证了FAP+成纤维细胞，并发现其在癌和癌旁组织间存在显著差异（Diff=42.4%, p=0.0052)。结直肠癌患者的FAP+成纤维细胞浸润程度较高，可以缩短PFS。RNA velocity分析发现，FAP+成纤维细胞是由FGFR2+成纤维细胞或者 ICAM1+ telocytes分化而来，而且该过程受转录因子TWIST1调控，TWIST1是低氧诱导通路的关键因子。
◾ 肿瘤特异性SPP1+巨噬细胞与CRC进展相关
CRC患者髓系细胞的重构提示其在肿瘤发生中具有功能作用。作者共鉴定到了9个髓细胞亚类，其中SPP1+巨噬细胞参与ECM -受体相互作用、PPAR信号通路和糖酵解/糖异生，SPP1+巨噬细胞可能受到HIF-1信号通路的调控，且该通路是低氧诱导通路。由于FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞与缺氧诱导通路密切相关，作者假设在肿瘤缺氧区域存在一种间质细胞介导MSC和巨噬细胞之间的网络来协同加剧CRC微环境的恶化。
◾ FAP+纤维母细胞和SPP1+巨噬细胞的高浸润与患者生存差相关
高FAP+成纤维细胞和高SPP1+巨噬细胞的患者PFS最短，提示这两种细胞类型可以协同促进肿瘤进展。免疫荧光标记显示在CRC组织中，SPP1阳性细胞和FAP阳性细胞空间位置较近，暗示这两种细胞之间存在潜在的交互。
◾ 空间转录组学揭示了FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的细胞-细胞相互作用
为了进一步评估FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的空间位置，作者对4例CRC患者的肿瘤组织切片进行了空间转录组学(ST)研究。共鉴定到10个簇，即FAP+成纤维细胞/SPP1+巨噬细胞、恶性上皮细胞、上皮细胞、MSCs、MT+纤维化细胞，FAP+成纤维细胞，肌成纤维细胞，内皮细胞，免疫细胞。基于scRNA-seq数据(前25个特异性表达基因)的FAP+成纤维细胞或SPP1+巨噬细胞标记基因，作者发现， FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞共同定位在同一位点的簇中。而且被恶性上皮细胞包裹。此外，在4个ST数据集中，作者发现FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞在促进结缔组织结构形成的通路中高度活跃，包括细胞外基质组织、胶原纤维组织和对TGF-β的响应微环境。因此，作者认为促结缔组织增生的微环境可能受到FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞相互作用的调控，从而限制免疫细胞向肿瘤核心的浸润。最后，作者还发现，FAP+成纤维细胞和SPP1+巨噬细胞的高浸润与免疫治疗耐药性相关。
基于以上研究，作者揭示了CRC微环境中免疫和非免疫细胞的详细情况，并强调了识别和开针对FAP+成纤维细胞，SPP1+巨噬细胞开发靶向治疗策略的潜在价值。
参考文献：
Qi, J., Sun, H., Zhang, Y. et al. Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer. Nat Commun 13, 1742 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-29366-6
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部分伯豪生物空转组织切片和HE染色图
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