项目文章|伯豪生物circRNA测序助力在肢端和皮肤黑色素瘤的转移中发挥重要作用的调控因子--circZNF609
标题：FMRP ligand circZNF609 destabilizes RAC1 mRNA to reduce metastasis in acral melanoma
and cutaneous melanoma
期刊：Journal of Experimental & Clinical Cancer Research（IF=11.161）
研究背景
黑色素瘤是一种恶性肿瘤，侵袭性高，预后差。目前，黑色素瘤的转移仍然是黑色素瘤患者死亡的重要原因。然而，大多数环状RNA (circRNAs)在黑色素瘤转移中的潜在功能和分子机制尚不清楚。通过研究发现：circZNF609在黑色素瘤组织和细胞中稳定低水平表达，与黑色素瘤患者的Breslow深度、临床分期和预后呈负相关，circZNF609在体内外抑制肢端和皮肤黑色素瘤的转移。另外发现FMRP与circZNF609在皮肤黑色素瘤和肢端黑色素瘤中相互作用。
主要结果
1、 黑色素瘤细胞中circZNF609的鉴定及其特征
为了研究黑色素瘤转移的关键驱动分子，首先应用细胞侵袭模型来模拟体外侵袭过程 (图1a)。经过7次连续筛选，建立了高侵袭性HMY-1亚群，并通过体外Transwell侵袭实验和体内肺转移实验(图1c)进一步验证了转移能力。随后，使用人类ceRNA阵列对HMY-1细胞和高侵袭性HMY-1细胞进行了circRNA转录组分析（伯豪生物提供了ceRNA芯片服务）。在这些具有不同转移能力的细胞中，共发现了13,378个失调的circRNA，通过筛选发现了4种异常调控的环状RNA;并且发现只有circZNF609在皮肤黑色素瘤和肢端黑色素瘤中下调 (图1d)。所以本实验在肢端黑色素瘤和皮肤黑色素瘤中研究circZNF609。
图1
2、 circZNF609在黑色素瘤中表达下调，与黑色素瘤进展及预后相关
接下来，研究检测了circZNF609在人黑色素瘤中的表达，qRT-PCR结果显示，与正常细胞系相比，circZNF609在12个皮肤黑色素瘤细胞系和3个肢端黑色素瘤细胞系中表达下调（图2a）；与早期黑色素瘤相比，circZNF609在转移组织中表达也下调（图2b）；同时远处转移、Breslow深度较深的皮肤黑色素瘤患者circZNF609表达也较低（图2c-e）；有趣的是，研究还发现circZNF609的丰度与黑色素瘤侵袭深度显著负相关(图2f)；同时，circZNF609的低丰度也与较短的总生存期(OS)相关(图2g)。
图2
3、 circZNF609体外抑制黑色素瘤细胞转移
为了测试circZNF609是否会影响黑色素瘤转移，我们进行了功能丧失和功能获得试验。我们首先设计了3个siRNA:一个靶向circZNF609的后剪接区，另一个靶向ZNF609 mRNA中的一个序列，第三个靶向线性和圆形转录本中都存在的一个序列（图3a）。
为了研究circZNF609对黑色素瘤细胞转移表型的影响，我们选择了2个皮肤黑色素瘤细胞系(A2058和A875)和2个肢端黑色素瘤细胞系(HMY-1和LM-MEL-45)。A875和LM-MEL-45保持circZNF609基础高表达，A2058和HMY-1保持circZNF609基础低表达。Transwell实验和创面愈合实验表明，circZNF609沉默后，2个皮肤黑色素瘤细胞系和2个肢端黑色素瘤细胞系的迁移和侵袭能力显著增强, 同样，circZNF609在4个黑色素瘤细胞系的异位表达导致细胞迁移和侵袭能力显著下降(图3c-d)。此外，在3D侵袭实验中，我们观察到LM-MEL-45细胞中circZNF609的缺失导致了侵袭区域的增强和突起数量的增加。相反，稳定的circZNF609过表达显著减少了侵袭面积和突起的数量。综上所述，这些发现表明circZNF609在细胞模型中的调节改变了皮肤黑色素瘤和肢端黑色素瘤的体外迁移和侵袭。
图3
4、 circZNF609在体内抑制黑色素瘤转移
为了确定circZNF609在体内对黑色素瘤转移的影响，通过植入转染了circZNF609或载体的黑色素瘤细胞，建立了肺和肝转移模型。将转染circZNF609或载体的表达荧光素的A2058细胞通过尾静脉注射接种到雌性裸鼠体内，在麻醉下使用体内荧光素酶成像进一步监测和分析小鼠的肺转移。观察到circZNF609在皮肤黑色素瘤A2058细胞异位表达后，肺转移明显受到抑制(4a,c,d)，OS较对照组延长（4b）。此外，在肢端黑色素瘤细胞系HMY-1中也证实了circZNF609抑制肢端黑色素瘤肺转移的作用。肢端黑色素瘤肺转移实验结果显示，circZNF609过表达组肺结节数量少于对照组（4e-g）。为了探讨circZNF609对肝转移的影响，进一步将表达荧光素酶的HMY-1细胞注射到雌性NOG小鼠的下半脑，与预期的一样，过表达circZNF609组肝脏发光较弱，肝脏转移结节较少（4h-j），证明circZNF609的异位表达抑制肢端黑色素瘤的肝转移。综上所述，circZNF609在体内可抑制皮肤黑色素瘤和肢端黑色素瘤的转移。
图4
5、 FMRP在黑色素瘤中与circZNF609相互作用
接下来探究了circZNF609作为肿瘤抑制因子的潜在分子机制。通过重叠starBase、circrc、CircInteractome和circAtlas中circZNF609序列中RBP识别元件的预测结果，只获得了1个候选的circZNF609互作蛋白—FMRP（5a）。我们假设circZNF609可能与FMRP相互作用并调节其功能。通过IF和FISH检测，我们观察到内源性表达的circZNF609和FMRP蛋白在皮肤黑色素瘤和肢端黑色素瘤细胞的细胞质中共定位。提示circZNF609可能与FMRP关联发挥功能。此外，我们对HMY-1肢端黑色素瘤细胞(图5d, e)和A875皮肤黑色素瘤细胞(图5g, h)进行了RNA拉下实验（Pull-down assay）、银染（silver staining）和western blot分析，结果显示FMRP是一个假定的circZNF609结合蛋白。此外，我们在FMRP免疫沉淀（RIP）实验中观察到circZNF609显著富集(图5f, i)。综上所述，这些数据表明，FMRP与circZNF609在皮肤黑色素瘤和肢端黑色素瘤中相互作用。
图5
参考文献：
Shang Q, Du H, Wu X, et al. FMRP ligand circZNF609 destabilizes RAC1 mRNA to reduce metastasis in acral melanoma and cutaneous melanoma[J]. Journal of Experimental & Clinical Cancer Research, 2022, 41(1): 1-18.
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