circRNA是一类具有调控基因表达潜能的非编码环状闭合RNA。随着NGS的发展及生物信息分析的进步，现在已经发现在动物细胞中，存在着成千上万的circRNAs。而对其功能的研究发现也表明，circRNA可以作为microRNA的海绵吸附体而影响下游靶基因的表达，是一种典型的ceRNA作用机制。另外， 由于circRNA与其相同来源的线性mRNA的序列高度相似性，可通过cis调控其母基因的表达。来自中国科学技术大学的研究人员通过对circRNAs分子作用机制的研究为我们提供了circRNA研究的新思路。已有研究表明ncRNAs可以参与转录调控。因此，为了直接找到相关的circRNA，研究人员用CLIP实验，筛选了能特异性地与RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）结合的ncRNAs。在HeLa细胞中将PolⅡ CLIP样本进行RNA高通量二代测序，共鉴定到111个circRNAs，同时也发现大部分的circRNA表达丰度比较低。对15个表达高的circRNAs进行了RNAIP和RT-PCR验证，发现一些circRNAs（circCLTC），特异性地在HeLa和HEK293 cells细胞中表达。
另外，研究人员也对其中的两个，circEIF3J和circPAIP2进行了northern blotting和RT-PCR验证，表明在这些circRNAs中，外显子间的内含子是保留的。研究人员将这部分特异性保留内含子的环状RNA为intron-containing circRNAs（EIciRNAs）。FISH实验表明circEIF3J和circPAIP2定位于细胞核中，表明他们可能通过与PolⅡ结合而调控基因的转录过程。
1 可以带着侧翼序列过表达
之前的研究表明circRNAs的外显子侧翼序列包含有Alu原件，侧翼序列由于序列的重复而成环。对15个验证的circRNAs序列进行分析发现其中有4个是包含有侧翼Alu原件，另外4个不只包含侧翼Alu原件。研究人员将不包含和包含侧翼序列，包含1-kb互补重复序列的circEIF3J和circPAIP2构建载体转染细胞，发现包含侧翼序列的circEIF3J和circPAIP2都能在HeLa和HEK293细胞中表达明显增加。该研究表明，包含有侧翼序列的circRNA是可以进行过表达构建的。该构建有便于对circRNA进行功能研究。
2 通过cis模式调控基因表达
为了研究EIciRNAs的调控功能，研究人员首先对circEIF3J和circPAIP2进行了敲降实验（siRNA or ASOs）。RT-PCR检测发现母基因的mRNA表达明显降低，而对EIF3J和PAIP2基因附近的其他基因表达没有明显影响。为了确认母基因转录的影响，将敲降后的细胞进行run-on实验，表明EIF3J和PAIP2的转录水平确实降低。但当将EIF3J和PAIP2的mRNA进行敲降后进行run-on实验，EIF3J和PAIP2的转录水平没有显著性影响，circEIF3J和circPAIP2的表达水平也没有收到影响。用前面实验的载体进行过表达后发现，EIF3J和PAIP2的mRNA表达水平没有明显变化。RNA-DNA双FISH实验表明circEIF3J和circPAIP2除了在母基因区域出现外，在整个细胞一半以上区域都共定位。该部分结果表明circEIF3J和circPAIP2可能通过cis模式调控基因的表达。
3 可以与PolⅡ，U1 snRNP和基因启动子结合
为了找到与EIciRNA特异性结合的蛋白，研究人员进行了 pulldown实验，发现除了PolⅡ外，U1A和U1C蛋白和U1小核RNA(snRNA)都能与circEIF3J和circPAIP2结合。进一步的染色质结合实验（ChIRP）表明EIciRNA可以结合到其母基因的启动子区域。ChIP实验表明U1 snRNP可以结合到EIF3J和PAIP2的启动子区域。该结果表明，circEIF3J和circPAIP2可能通过与U1 snRNP和PolⅡ形成复合体，结合到其母基因的启动子区域调控其表达。
4 U1 snRNP 是EIciRNAs行使cis调控必需的
为了确认U1 snRNP是否调控了EIciRNAs的功能，研究人员用U1阻塞剂（AMO）消除U1 snRNP表达，发现可以抵消因为EIciRNA敲降而引起的对母基因表达的影响。同时，run-on实验表明，U1 AMO处理可以减少EIF3J和PAIP2的转录水平。另外，U1 AMO处理也减弱了PolⅡ和EIciRNAs的结合效率。EIciRNAs和母基因启动子区的结合也降低。当敲除EIciRNAs后，PolⅡ与U1 snRNP蛋白与其母基因启动子的结合也减弱。FISH实验验证了EIciRNA和U1 snRNA在细胞核中与母基因的共定位。该结果表明U1 snRNP 是EIciRNAs行使cis调控必需的。
5 的结合对功能行使非常重要
既然U1 snRNA能和EIciRNAs结合行使功能，那么，U1 snRNA结合的位点在哪？通过序列分析发现，在EIciRNAs的5’端保留的内含子区域含有一个U1 snRNA结合位点。研究人员用AMO阻断该位点后发现U1 snRNA和EIciRNAs的结合能力降低。同时，PolⅡ CLIP 实验也验证了AMO阻断后PolⅡ和EIciRNAs的结合也降低，run-on表明母基因的转录水平也相应的下降。ChIP和ChIRP实验分别表明，用AMO进行阻断后，U1 snRNP和EIciRNA与母基因启动子的结合能力也降低。该结果表明这种特异的U1 snRNA和EIciRNA结合对于EIciRNA转录调控的获得是非常必要的。
最后，依据以上实验的结果，研究人员绘制了一种名为EIciRNAs的环状RNA调控基因表达的作用模式图，为我们理解circRNA的调控机制提供了强有力的参考。
circRNA由于其特有的形态结构和功能机制，使得对环状RNA的研究起步比较晚。但是，作为一个具有重要调控作用的非编码分子，circRNA是目前以致未来几年内转录组研究领域中热点中的热点。从现有发表的文献可以看到，由于环状RNA特有的环形结构以及表达丰度低、功能作用方式未知等原因，目前可循或可参考的资料非常非常少。该文献从前期筛选，结构分析，下游基因及调控模式探究等方面提供了方法学和思路的详尽描述，为我们想赶在第一波就进入该研究领域的科研人员提供了参考。
原文出处：Li Z, Huang C, Bao C, Chen L, Lin M, Wang X, Zhong G, Yu B, Hu W, Dai L, Zhu P, Chang Z, Wu Q, Zhao Y, Jia Y, Xu P, Liu H, Shan G. Exon-intron circular RNAs regulate transcription in the nucleus. Nat Struct Mol Biol. 2015,256-64.