circular RNAs是近年来发现的一类新的具有调控功能的非编码RNA。circular RNAs广泛存在于生物发育各个阶段，由于其封闭环状的特性而能稳定存在。现有研究认为circRNAs可以通过作为miRNA的海绵吸附体调控基因的表达。circRNAs是否可以通过其他的形式行使功能呢？今天，小编和大家一起通过一篇发表在《Nucleic Acids Research》上的研究来了解下circRNAs通过和蛋白形成复合体影响细胞周期的生物学功能。
Foxo3是一个参与癌症发展过程的基因，通过增强Akt的活性或者抑制PTEN的活性而抑制肿瘤发展。已有研究表明，上调Foxo3会影响细胞周期过程而减少细胞衰老。circular Foxo3（circ-Foxo3）和线性Foxo3都来源于Foxo3基因。既然Foxo3影响了细胞周期过程，circ-Foxo3是否也参与其中呢？本研究通过一系列的实验证明，circ-Foxo3可以和p21与CDK2形成三元复合体，抑制了细胞周期过程。
人和小鼠的同源性比较高，为了便于研究，研究人员检测了小鼠肿瘤细胞系中circ-Foxo3（人和小鼠circ-Foxo3有91%同源性）和Foxo3的表达，发现肿瘤细胞系和非肿瘤细胞系中circ-Foxo3和Foxo3的表达呈负相关性。因此，该结果暗示circ-Foxo3可能也参与了细胞周期过长和增殖过程。细胞系培养和细胞周期分布与circ-Foxo3表达检测表明，circ-Foxo3表达水平在细胞周期抑制时显著增加。在用细胞增殖因子表皮生长因子（EGF）处理后circ-Foxo3表达水平显著减少，而在增加EGF抑制子AG1478时会显著增加。因此，circ-Foxo3的表达和细胞周期与细胞增殖相关。
为了确认circ-Foxo3在细胞周期过程中的作用，研究人员用siRNA敲降了circ-Foxo3。细胞增殖assay检测表明circ-Foxo3 siRNA增加细胞增殖能力。细胞周期分析显示大部分的circ-Foxo3 siRNA细胞处于S和G2期。因此，敲降circ-Foxo3 siRNA提高了细胞周期过程。
此外， 研究人员检测了circ-Foxo3转染细胞系的细胞增殖能力。结果显示，circ-Foxo3 转染细胞系NIH3T3的增殖速度变慢。细胞周期分析显示更多的转染细胞停滞在G1时期。
小结
以上做了一系列的细胞表型实验，无论是siRNA还是过表达转染，最后想说明的问题是，circ-Foxo3的表达异常影响了细胞周期和细胞的增殖能力。找到了生物学表型，接下来的问题是内在的作用机制是什么？
本研究的思路比较特殊，研究人员想看看是否有和circ-Foxo3结合的相关细胞周期蛋白。IP实验表明，circ-Foxo3可以特异性拉下CDK2，CDK6，p16，p21和p27。反向IP实验表明这些蛋白也能在转染细胞中拉下更多的circ-Foxo3。其中，CDK2和p21的作用更为显著，CDK2和p21在主要在G1时期的细胞中能拉出circ-Foxo3。因此，研究人员猜测CDK2和p21参与了circ-Foxo3调控细胞周期过程。
为了验证这三者之间的互作关系，研究人员又做了进一步的验证实验。首先，Western blot分析表明在circ-Foxo3转染的细胞中，CDK2能结合更多的p21，对照细胞中结合更多的cyclin A 和cyclin E。同时，转染细胞中，cyclin A 和cyclin E也是拉下更少的CDK2。另外，研究人员也试着将其他的分子（circ-Amotl1和Foxo3）转染测试CDK2和p21的结合能力，结果显示p21可以特异性的在circ-Foxo3转染细胞系中拉下CDK2，CDK2也是特异性的在circ-Foxo3转染细胞系中拉下p21。
由于circ-Foxo3是特异性的存在于G1时期，因此，研究人员在G1时期的细胞也进行了检测。结果显示，G1时期p21可以拉下更多的CDK2。同样，在G1时期，CDK2可以拉下更多的p21。
以上的实验来回进行两两作用验证，最终的结论指向一个，circ-Foxo3，CDK2和p21很有可能形成了三元复合体。为了验证该假设，研究人员又进行了一系列实验。结果显示，在circ-Foxo3转染细胞中，p21形成略大于CDK2和p21大小相加的蛋白，而在对照细胞系中，主要是p21的单体蛋白。CDK2的实验也同样验证了在转染细胞中，会形成集合p21的dimer。
小结
以上进行了一系列实验说明了一个问题，circ-Foxo3可以和CDK2和p21形成三元复合体。
既然circ-Foxo3和CDK2，p21形成复合体。那么，破坏该复合体会引起什么变化呢？研究人员首先在siRNA circ-Foxo3细胞中IP检测CDK2和p21，结果显示和p21结合的CDK2减少了，和CDK2结合的p21也减少了。
同样，对siRNA细胞系和对照细胞进行检测表明，siRNA细胞系中p21和CDK2主要以单体存在。
当把p21和CDK2敲除后，p21和CDK2探针拉下的circ-Foxo3也变少。
因此，破坏复合体中任何一个，直接影响整个复合体的形成。
另外，为了验证circ-Foxo3特异性结合CDK2和p21，研究人员用circ-Foxo3用来Northern blot的探针pull down p21和CDK2。结果显示，circ-Foxo3转染细胞系能拉下来，而siRNA细胞系拉下很少。在p21 siRNA细胞系只能拉下CDK2，CDK2 siRNA只能拉下p21，表明在细胞中存在着circ-Foxo2-CDK2和circ-Foxo2-p21复合体。
为了进一步验证复合体的稳定性，研究人员用RNAse A 处理了circ-Foxo3转染细胞和对照。发现转染细胞中还是能检测到CDK2和p21。因此，circ-Foxo3能保护CDK2和p21而维持三元复合体的稳定。
小结
该部分结果表明circ-Foxo3，CDK2，p21形成的三元复合体彼此依赖，circ-Foxo3还起到保护CDK2和p21被降解的可能。
该研究是一篇典型的分子作用机制探究报道。该研究通过正反向，敲除过表达，不同细胞系等实验，反复验证了circ-Foxo3能与CDK2和p21形成复合体，影响细胞周期和增殖过程。为我们拓宽circRNA的生物学功能提供了新的见解，非常值得大家参考。【温馨提示】本文为微信号：基因芯片知识屋（bio-microarry）原创文章，如需转载请注明来源：基因芯片知识屋。