重温山中伸弥发现iPS的研究历程（含2016年ISSCR山中伸弥最新研究进展）

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原题目：从骨科医生到诺贝尔奖——山中伸弥发现iPS的研究历程

作者：李宗金

山中伸弥（Shinya Yamanaka）获得诺奖已经有几天了，虽然两年前在听完他的讲座后我兴致很高地写了两篇博客，这些天我却没有多少动力再写一篇完整的文章来介绍他的工作。 　　

我一直对中国现在还盛行的规划性科研，应用导向型科研耿耿于怀。这些所谓的重大项目在立项的当初对目标/前景写得宏大无比，之后却通常草草收场。如果那些重大项目真的能实现立项当初的用意，那诺贝尔奖早就在中国遍地开花了。广大科研人员都觉得这种运行模式是一个笑话，饶毅、施一公等大牛也重炮轰击，但是分钱游戏还在进行着。而公众，包括相当一部分科研人员也并不了解科研的自身规律，总是一再地问做基础研究有什么用。 Shinya Yamanaka的成功是典型的小实验室自由探索的成功。他的成功再一次提示，有相当多的科学突破是不可预测的。如果中国有大批优质的小实验室得到稳定的资助，那么类似的科学突破就会随机但是必然地产生。从这种意义上讲，展示Shinya Yamanaka在研究过程中的这种随机性和必然性，向公众科普科研活动是如何进行的，是值得我花一点时间的。 　　

解析Shinya Yamanaka发现诱导干细胞（iPS）的来龙去脉比较简单，就是跟踪他顺次研究的基因：ApoBEC1-Nat1-Fbx15，最后发现iPS。有趣的是他在顺次研究这些基因的时候转了两次方向：ApoB是血脂蛋白，研究它的编辑酶ApoBEC1是为了调节血脂，但是却意外发现过表达ApoBEC1的小鼠得了肝癌；为了研究致癌机理，Shinya找到ApoBEC1的下游蛋白Nat1，Nat1的敲除导致小鼠在胚胎期死亡，以及胚胎干细胞在体外无法分化；于是他又开始研究起胚胎干细胞，找到许多胚胎干细胞特异表达的基因，其中之一是Fbx15，最后用Fbx15敲除鼠建立assay（筛选方法/系统），幸运地筛选出了iPS。 　

从骨科外科到博士阶段 Shinya Yamanka念高中时迷上柔道，因为受伤经常上医院，他在爸爸的建议下随后考入国立神户大学医学部，准备以后做一名骨科外科医生。大学毕业做临床实习期间，他发现自己对手术其实没有什么天分，别人做20分钟的手术他两个小时也未必完成；并且他觉得做医生再优秀也只能帮助少数的病人，而医学研究有成果的话通常可以帮助更多的病人，所以他的兴趣转向基础医学研究。在大阪市立大学博士期间，Shinya的主要工作是研究血压调节的分子机理[1, 2]。在研究过程中，Shinya对小鼠转基因和基因敲除技术感到震惊，于是他在申请博士后位置的时候联系的都是利用这些技术的实验室。 　　

Shinya Yamanaka和他的导师Thomas Innerarity在Gladstone Institute实验室

博士后阶段-ApoBEC1 1993年，这位失败的骨科医生最后被加州Gladstone Institutes的Thomas Innerarity纳入门下。Thomas实验室研究的是血脂调节，跟Shinya博士期间的工作有点关系。Shinya的新课题是研究ApoB mRNA的编辑蛋白ApoBEC1。 ApoB是低密度脂蛋白的主要构成成分。ApoB mRNA可以被编辑酶ApoBEC1脱氨提前终止翻译，形成两种不同大小的蛋白：全长的ApoB100和大约一半长的ApoB48。经编辑后的ApoB48在血浆中会被迅速清除。Thomas预测，在肝脏中过表达ApoBEC1，血脂可能降低；如果这个模型可行的话，也许未来通过基因疗法可以帮助一些肥胖病人降低血脂。 Shinya一周七天地勤奋工作，花了六个月做成了转基因鼠。有一天早上，帮他维护小鼠的技术员告诉他：Shinya，你的许多小鼠都怀孕了，可是它们是公的。Shinya说你不是跟我开玩笑吧。他到老鼠房一看，果真有很多公鼠看起来怀孕了。他解剖了其中几只，发现原来是小鼠得了肝癌，肝脏肿大撑大了肚皮。 ApoBEC1过表达后低密度脂蛋白是降低了，但是高密度脂蛋白却升高了，同时还得了肝癌，这买卖不合算啊[3]。Shinya在一次讲座中总结了其中的经验教训：其一，科学是不可预测的；其二，不要尝试在病人身上做新基因的治疗；其三，也许最重要的是，不要相信导师的假说。 Thomas对结果不能符合预期很失望，但是这个预想之外的结果却勾起了Shinya的好奇心：究竟是什么机理使小鼠得肿瘤的呢？好在Thomas足够开明，他允许Shinya偏离实验室的主攻方向，继续探索ApoBEC1的致癌机理。可以想见，ApoBEC1过表达以后也可能会编辑ApoB之外的其它mRNA，找到这些mRNA也许可以解释ApoBEC1为什么能致癌。 　　

由于已知ApoBEC1需识别底物mRNA的特异序列才能编辑，Shinya据此设计引物扩增，找到了ApoBEC1的一个新底物-抑制蛋白翻译的基因Nat1。ApoBEC1过表达后，Nat1蛋白消失[4]。从逻辑上讲，如果Nat1是导致ApoBEC1致癌的重要分子，那么Nat1敲除的小鼠也会长癌。基因敲除比起转基因要更加复杂，需要把构建的质粒原位整合到体外培养的胚胎干细胞中。基因敲除技术不就是Shinya博士阶段做梦都想学的技术吗？于是Shinya找到所里做基因敲除的专家，当时还是助理教授的Robert Farese，从他的助手Heather Myers那里学了这项技术的每个细节，并成功地获得了Nat1敲除的杂合鼠。Heather Myers是Shinya的终生好友；Shinya发现iPS以后，也公开表达了对Heather Myers的感激，因为是她告诉Shinya，胚胎干细胞不仅仅是做敲除小鼠的手段，其本身也可以是非常有趣的研究对象。在Shinya兴致勃勃地继续追问Nat1的功能时，他的妻子带着女儿离开他回到了日本。半年后他决定中断研究带着三只珍贵的Nat1杂合鼠，也跟随家人回国。 　　

大阪的毛毛虫阶段-Nat1 　　

凭借他在博士后期间发表的四篇高质量的一作论文，1996年Shinya在母校大阪市立大学找到了助理教授的职位，继续他的Nat1研究。再一次地与预测出现偏差：Nat1敲除后，纯合子小鼠在胚胎发育早期就死了，根本无法观察到成鼠是否得肿瘤。Shinya进一步研究发现，敲除Nat1的胚胎干细胞在体外不能像正常干细胞一样分化[5]。此时他想起了Heather Myers的话：胚胎干细胞不仅是工具，它本身也可以是非常有趣的研究对象。他的关注点开始转移到胚胎干细胞上来。在刚回大阪的头几年，Shinya由于刚起步，只能得到少量的基金资助，他不得不自己一个人养几百只小鼠，日子过得非常艰苦。同时大阪市立大学医学院的基础研究很薄弱，周围的人不理解Shinya研究Nat1在胚胎干细胞中的功能有什么意义，总是劝说他做一些更靠近医药临床方面的研究。而Nat1的研究论文提交给杂志后一直被拒稿。种种压力与不得志，Shinya因之得了一种病叫PAD（Post America Depression，离开美国后的抑郁症；自创的玩笑话），几乎要放弃科研回锅做骨科医生。在他最低谷的时候，有两件事情把他从PAD中挽救了回来。其一是James Thomson（俞君英的导师，2007年几乎与Shinya同时宣布做出了人的iPS）在1998年宣布从人的囊胚中采集并建立了胚胎干细胞系，这些干细胞在体外培养几个月后还可以分化成不同胚层的细胞，比如肠上皮细胞，软骨细胞，神经上皮细胞等[6]。这给了Shinya巨大的鼓舞，他开始更加坚信胚胎干细胞研究是有意义的，将来必然有一天会用于临床。第二件事是条件更加优越的奈良先端科学技术研究生院看上了他的特长，招聘他去建立一个做基因敲除小鼠的facility（中心？设施？），并给他提供了副教授的职位。 　　

奈良的成蛹阶段-Fbx15 　　

千辛万苦脱了几层皮后，Shinya终于拥有了自己独立的实验室。第一次可以招帮手，好爽啊。但是问题又来了：研究生的生源是有限的，学生会倾向于选择资历更老条件更好的实验室，而不一定会选择刚起步的实验室。为了吸引学生到他实验室，Shinya冥思苦想了好一阵，提出了一个雄心勃勃的计划，声称实验室的远景目标是研究怎么从终末分化的成体细胞变回多能的干细胞。当时科学界的主流是研究怎么把胚胎多能干细胞分化成各种不同组织的细胞，以期用这些分化的功能细胞取代受损的或者有疾病的组织细胞。Shinya认为自己的实验室没有实力跟这些大牛竞争，那不如反其道而行之，研究怎么从分化的细胞逆转为多能干细胞。当时科学界的主流观点认为，哺乳动物胚胎发育过程中的细胞分化是单向的，就像是时间不可逆转。这个观点也并非没有破绽，比如植物组织就具有多能性：一些植物的茎插入土壤会重新长出一棵植株，也即已经分化的茎细胞可以改变命运分化出新的根茎叶细胞。而早在1962年，也即Shinya出生的那一年，英国的John Gurdon爵士（与Shinya共享诺贝尔奖）报道了他的惊人发现：把蝌蚪的肠细胞核移植到去核的蛙卵中，新细胞可以发育至蝌蚪阶段[7]。如果把杂合细胞发育到囊胚期，用囊胚期的细胞核再做一次核移植，那么就可以发育出可生育传代的成蛙[8]。进一步地，为了说服人们接受终末分化的细胞核也具有多能性，他把成蛙不同组织的细胞进行体外培养，发现核移植后来源不同的杂合细胞都可以发育到蝌蚪阶段[9]。1997年，Ian Wilmut和Keith Campbell基于同样的原理，把羊的乳腺细胞核移植到去核的羊卵中，成功地培育出了克隆羊多莉[10]。2001年，日本科学家发现，通过与干细胞融合，胸腺细胞核获得了很大程度的重编程[11]。 Shinya计划的第一步是找到尽可能多的，类似于Nat1参与维持干细胞功能的因子（维持因子的意思是这些因子是胚胎干细胞在体外培养维持多能性所必需的）。他大胆推测，在分化的细胞中过表达这些维持因子也许可以让它变回多能干细胞。一旦成功，诱导的多能干细胞会有着胚胎干细胞所不具备的优势：它不仅可以绕开胚胎干细胞引起的伦理问题，病人本身的诱导干细胞改造后重新植入病人时，由于是自身的细胞，将不会有免疫排斥的难题。在这个远大前景的感召下，Shinya果然“忽悠”了三个学生加入他实验室。很快地，他们鉴定出一系列的在胚胎干细胞特异表达的基因。其中一个基因就是Fbx15。

Shinya的学生Yoshimi Tokuzawa发现Fbx15除了特异表达于胚胎干细胞外，它还能被另外两个胚胎干细胞维持因子Oct3/4和Sox2直接调控。Shinya跟Yoshimi说：Fbx15应该参与维持干细胞多能性和胚胎的发育，我猜你没有办法得到Fbx15敲除的纯合鼠。Yoshimi构建质粒做了基因敲除小鼠，把染色体上的Fbx15基因通过同源重组替换成抗G418药物的基因neo。复杂的生命又一次愚弄了Shinya：Fbx15敲除的纯合鼠活得很健康，没有显见的表型。Shinya又挑战他的学生说：好吧，Fbx15也许不是小鼠胚胎发育所必需的，但是它应该是维持体外胚胎干细胞所必需的，我打赌你没有办法在胚胎干细胞中彻底敲除这个基因。勤快的Yoshimi于是用较高浓度的G418从干细胞中筛到了纯合的敲除株，还是活得好好的，没有表型[12]。Shinya后来在回忆的时候打趣到：小鼠很happy，细胞也很happy，唯一不happy的就是可怜的学生Yoshimi了。但是花这么多精力做的敲除小鼠不能就这么算了吧。Shinya又一次开动脑筋，想要废物利用。他发现由于Fbx15只在胚胎干细胞表达，Fbx15 promoter操控的抗药基因neo在成体的成纤维细胞里不表达，所以细胞在药物G418处理下会死亡；而敲除鼠里得到的胚胎干细胞却可以在很高浓度的G418中生长。如果成纤维细胞能通过某种因子诱导成多能干细胞，那么它就会产生对G418的抗药性。即便成纤维细胞只是获得了部分胚胎干细胞的特性，那么它也应该能抗低浓度的G418。Fbx15敲除鼠实际上提供了很好的筛选诱导干细胞的系统！ 　　

京都大学的化蛹成蝶阶段-iPS 　　

凭借他鉴定胚胎干细胞维持因子的出色工作，2004年Shinya在名气更大的京都大学找到了新的职位。除了Fbx15敲除鼠的筛选系统，Shinya还积累了他鉴定的加上文献报道的24个候选维持因子。Shinya跃跃欲试，他准备破壳而出，拍翅成蝶了！ Shinya的另一位学生Kazutoshi Takahashi此前已经发表了一篇关于干细胞致癌性的Nature文章。Shinya决意让他来承担最大胆的课题-逆分化成体细胞，因为他知道，有一篇Nature文章保底，即便接下来的几年一无所获，他的学生也能承受得了。

图二：筛选iPS的系统。在Fbx15敲除鼠基因组，Fbx15 基因被bgeo基因（β-galactosidase 和 neo的融合基因）取代。成鼠角形的成纤维细胞中，内源的Fbx15 promoter关闭，bgeo不能表达，细胞在G418药物处理下会死亡；在圆形的多能干细胞中，Fbx15 promoter会启动bgeo，细胞能在G418中生长。如果成纤维细胞感染携带干细胞维持因子的逆转录病毒，并能够被逆分化成干细胞，那么它就能逃过G418的选择压力，增殖形成细胞克隆。

即便有很好的筛选系统，这个课题在当初看来也是非常冒险甚至是不可行的。当时的人们普遍认为成体细胞失去了多能性，也许成体细胞本身就是不可逆转的，你做什么也没有用。即便通过转核技术实现了成体细胞核命运的逆转，那也只是细胞核，不是整个细胞。胚胎细胞和成体细胞的染色体是一样的，细胞核具有全能性，尚可理解。而且要实现细胞核的逆转还需要把核转到卵细胞中，让卵细胞质帮助它重编程，而卵细胞质中的蛋白不计其数。如果要实现整个细胞命运的逆转需要让细胞质中所有的蛋白重新洗牌。即便细胞可以重新编程，那也应该是很多蛋白共同参与的。Shinya当年在手上的仅仅是24个因子。也许有另外几百几千种因子被遗漏，缺少其中一种都无法实现重编程。用这24个因子异想天开要实现细胞命运的逆转，根据已有的知识从逻辑上讲可能性几乎为零。 Kazutoshi这个愣头青不管这些，他给成纤维细胞一一感染过表达这些因子的病毒，结果当然没有筛选到任何抗G418的细胞。Shinya知道如何保持学生的斗志，他故作镇定地说：你看，这说明我们的筛选系统很好啊，没有出现任何假阳性。 在试了一遍无果后，Kazutoshi大胆提出想把24个病毒混合起来同时感染细胞。Shinya觉得这是很愚蠢的想法：没人这么干过啊同学，不过死马当作活马医，你不嫌累的话就去试吧。等了几天，奇迹竟然发生了。培养板上稀稀疏疏地竟然出现了十几个抗G418的细胞克隆！一个划时代的发现诞生了。关键实验取得突破以后，其后的事情就按部就班了。Kazutoshi每次去掉一个病毒，把剩下的23个病毒混合感染成体细胞，看能长多少克隆，以此来鉴别哪一些因子是诱导干细胞所必需的。最后他鉴定出了四个明星因子：Oct3/4，Sox2，c-Myc和Klf4。这四个因子在成纤维细胞中过表达，就足以把它逆转为多能干细胞！ 　　那抗G418的细胞克隆就一定是多能干细胞吗？他们通过一系列的指标，比如基因表达谱，分化潜能等，发现这些细胞在相当大的程度上与胚胎干细胞相似。 2006年Shinya报道了小鼠诱导干细胞，引起科学界轰动[13]；2007年，他在人的细胞中同样实现了细胞命运的逆转，科学界沸腾了[14]。 　　

展望 　　

回过头来，种种不可能，Shinya怎么就成功了呢？现在通过更多的研究，我们知道，干细胞特性的维持是由一个基因网络来共同作用的，通过上调某些关键基因就可以重建这个网络，逆转细胞的命运；Shinya最后鉴定的这四个因子也不是必须的，用这四个因子以外的其它因子进行组合可以达到同样的目的。这好比是一张大网，你只要能撑起其中的几个支点，就可以把整张网撑起来。当然，Shinya的成功也有相当大的侥幸成分，假设在他的24个候选因子中缺了这四个明星分子中的一个，那么他无论怎么努力也没有办法得到iPS。 iPS的发现有着不同寻常的意义。首先，它更新了人们的观念，从此之后人们不再认为细胞的命运不可逆转，不单可以逆转，细胞其实还可以实现不同组织间的转分化（Transdifferentiation）。其次，iPS细胞绕过了胚胎干细胞的伦理困境，很多实验室都可以重复这个简单的实验得到iPS，开展多能干细胞的研究。其三，iPS细胞具有很多胚胎干细胞所没有的优势：来自于病人自身的iPS细胞体外操作后重新植入病人体内，免疫反应将大大减少；如果将病人的体细胞逆转为iPS细胞，在体外分化观察在这个过程中出现的问题，就可以实现在培养皿里某种程度上模拟疾病的发生；疾病特异的iPS在体外扩增和分化以后，还可以用于筛选治疗该疾病的药物，或者对药物的毒性进行检测。但是这仅仅是新的开始，生命科学如此复杂和不可预测，要把这些愿景变成现实，让iPS真正造福人类，这其中还有重重的困难。Shinya Yamanka，这位科学的宠儿，怀着最初帮助更多病人的理想，无畏地踏上了新的征程。 　　

独家透露：2016全球干细胞年会昨晚传来消息，Shinya Yamanka向所有参会者汇报了一个惊人的研究结果，NAT1可以让iPSC从prime阶段回到naive阶段。意思是说以前四个基因诱导iPSC，现在一个NAT1就可以了。（具体data未公布，文章还未发表）

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