CRISPR遭遇信任危机，放眼四大基因编辑技术探讨如何规避「脱靶」风险丨医麦精品汇
今天是2017年6月4日
农历五月初十 ASCO 2017
医麦客 向全球癌症攻坚者致敬
基因编辑复活恐龙，龙粮你准备够了吗？
有人说，人类是这个地球上最孤独的种群，因为他们扩散到哪里，哪里的野生动物就会灭亡。不过，现代科学技术的发展已经到了“起死回生”的地步，或许我们可以将那些已经灭绝的动物重新带回来。
小伙伴们还记得那些年《冰河世纪》中萌萌的猛犸象吗？你能想象4000多年前销声匿迹的猛犸象重新出现在世人面前吗？科学家们正在谈论用一种强大的基因编辑技术让猛犸象起死回生，更有新闻报道称两年内便可梦想成真。
那是不是说
《侏罗纪公园》里的噩梦也要实现了呢？
但小编想问的是：“龙粮准备够了吗？”
基因编辑，指哪打哪
复活灭绝动物的可能性可不是小编杜撰的，毕竟基因编辑确实足够“黑科技”。
那基因编辑的神奇魅力何在呢？
它能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定基因片段的敲除、加入等。它就像一把手术刀，可以根据基因错误的位置进行修改。如果人类能够完全掌握基因编辑技术，面对许多疾病，人类将不再谈虎色变。从根本上避免致病基因遗传给后代，解决某些感染性疾病的预防和治疗难题，而且可能真的就像上帝造人那样，随心所欲地塑造“完美宝宝”。
目前人类应用的基因编辑工具中主要有三种：ZFN，TALEN和CRISPR-Cas，还有一种就是质疑不断的NgAgo技术。
ZFN技术
20世纪90年代，科学家发现，一种广泛存在的蛋白结构模块锌指(ZF)能够介导蛋白质与核酸间的相互作用，将这些模块化的锌指串联起来，所形成的蛋白能够特异性识别并结合DNA，这种蛋白就是锌指蛋白(ZFP)。研究发现，锌指蛋白可以实现对DNA的识别，由核酸酶进行精准切割。这也是第一个基因组编辑技术—锌指蛋白核酸酶技术(ZFNs)。
经过十几年的发展，锌指核酸酶技术已应用于果蝇、斑马鱼、大鼠、小鼠等多种模式动物的遗传研究，成功实现了基因的修饰。2005年，它还首次实现了对人类细胞基因的定点修饰。
ZFN特异性识别DNA并与DNA结合示意图。每个DNA识别域包含三个锌指，锌指从N端开始命名，在图中标示为F1、F2、F3。每个锌指结构分别与3个碱基发生直接接触，由此产生特异性。单独的FokI切割域不具有特异性识别能力，但当与锌指结构相连，并与另一个FokI切割域形成二聚体后，便能够对DNA双链进行切割。
值得我们注意的是，ZFN技术也存在着一定的缺陷。
其对DNA的剪切需要两个FokI切割区域的二聚化，并且需要至少一个识别单元结合DNA。DNA识别域虽然具有较强的特异性识别能力，但由于ZFN剪切的过程并不完全依赖同源二聚体的形成，所以一旦形成异源二聚体，就很可能造成脱靶效应，并最终可能导致DNA的错配和序列改变，产生较强的细胞毒性。当这些不良影响积累过多，超过细胞修复机制承受的范围时，便会引起细胞的凋亡。
另一方面，该手段仍然受到现有生物学领域研究手段的限制，因此在细胞内部操作的精确程度和后果都较难预料。如果ZFN引起相关基因突变，则可能会导致一系列意想不到的后果，在与人体相关的应用领域，甚至可能引发癌症。
另外，ZFN作为基因治疗的手段之一，如果在生物体内使用，可能会引发免疫反应。现有的研究手段尚不能预测引入的ZNF蛋白是否会引起免疫系统的进攻。并且到目前为止，ZFN技术只能用于体外操作，而直接向患者体内导入相关ZFN元件进行基因编辑处理则具有较大的潜在风险，且效率不高。以上诸多限制导致人体相关的ZFN操作较为繁琐，耗时费力，成本也高，因此没有得到大规模的应用。
TALEN技术
TALE是一种从植物病原体—单胞杆菌中分离出来的蛋白，这种蛋白能够通过特异性结合宿主DNA，调控其表达来提高病原体的致病性。TALE蛋白与锌指蛋白最大的不同体现在，TALE蛋白的重复单元与DNA的碱基是按照一对一的识别方式特异性识别的。而且相比使用锌指蛋白靶向DNA序列更加稳定，特异性也更高且不受序列的限制。
TALEN进行基因组编辑的原理。利用位点特异性核酸酶可以进行基因组编辑，而核酸酶诱导的DNA双链断裂（DSB）可由同源定向修复（HDR）或非同源末端连接途径（NHEJ）来修复。
理论上TALEN技术可以实现对任意基因序列的编辑，原理与锌指核酸酶技术相似。TALEN作为第二代基因组编辑核酸酶，与其它技术相比，其能更大程度上的地避免功能蛋白脱靶。
与锌指核酸酶相比，TALEN使用起来更简单、构建更迅速，并且价格更低廉。TALEN不像ZFN那样容易受周围连接环境绑定的影响，因此与ZFN相比，其设计和工程没有ZFN复杂。与此同时，由于它们具有与DNA靶位点结合的高度特异性，因此与其它工具酶相比较，TALEN产生的脱靶效应非常微弱。
但是装配TALEN编码质粒却是一个冗长的、高强度工作的过程。
CRISPR技术
20世纪80年代末，研究人员在观测大肠杆菌时发现，在细菌基因的尾端，有一些看上去很奇怪的重复序列。这些序列随后被命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）。病毒性感染就像定时炸弹，在它“爆炸”之前，细菌只有很短的时间来处理，而CRISPR就是一个“拆弹专家”。
CRISPR-Cas9
那CRISPR是如何“拆弹”的？
研究人员注意到，这些重复的序列之间总是由一些很古怪的间隔区隔开，这些间隔区之所以看上去很古怪，是因为它们根本就不是细菌自身所有的东西，而是从噬菌体病毒的DNA上“剪”下来的小片段。简言之，细菌细胞产生CRISPR相关蛋白（Cas蛋白），在病毒入侵之后，Cas蛋白便会结合到病毒DNA上，从上面“剪”下一块病毒DNA，然后将其转运到细菌细胞的基因组，插入其中，使之成为一处“间隔区”。
从此以后，细菌细胞便会利用这一间隔区来识别与之相对应的病毒，实现对病毒再次入侵的免疫应答。更神奇的是，CRISPR系统还可以将获得的部分DNA片段整合进基因组，形成记忆并遗传，从而可以保护后代的细胞免受病毒的攻击，就像随身带了一张基因的“疫苗接种卡”。
CRISPR的登场，把基因治疗的武器库升级到一种前所未有的高度。更便宜、更便捷、靶向更加准确。
NgAgo技术
除了以上三种基因编辑技术之外，2016年5月份，河北科技大学韩春雨副教授及浙江大学的团队平地一声炸雷，祭出NgAgo这个神奇的武器，基因编辑能力和脱靶副作用均大大优于已经接近完善的CRISPR技术。相比CRISPR/Cas9技术使用RNA引导，NgAgo基因编辑技术以DNA作为引导工具，可选择的靶点更多、准确性更高、脱靶效应更小。
NgAgo
但自问世以来便陷入了论文不可重复性的风波中。虽然至今都无人能证实，但很是赚足了眼球。不过尽管目前有不少科学家对NgAgo技术作为基因编辑技术存在质疑，但是河北科技大学基因编辑技术研究中心仍在积极推进以Argonaute核酸酶为核心的基因编辑技术开发及其相关知识产权的转化和应用。
总的来说，相比较ZFN、TALEN、甚至是存在质疑的NgAgo技术，CRISPR技术的更便捷、靶向更精准的优势则相当惹眼。CRISPR的另一个主要优点是“扩大”的能力。多种gRNA可同时用于编辑各种不同的遗传基因座，为研究涉及由多个基因引起的疾病提供可能。
CRISPR可以说是一种革命性的技术，没有任何一种技术能如CRISPR这般快速横扫整个生物学界。但毕竟这项技术比较新，因此其治疗学方面的发展明显落后于其他基因编辑技术。并且目前还不清楚CRISPR技术在未来是否能被证明适用于人类健康治疗。就目前看来，其易产生脱靶效应仍是一项重大的挑战。
遭遇“大危机”，数百种意料外的脱靶突变
5月30日，《NatureMethods》期刊上的一篇题为 Unexpected mutations after CRISPR-Cas9 editing in vivo的一篇通信文章显示，来自美国哥伦比亚大学等研究机构的科学家确认通过CRISPR基因编辑技术成功修复了导致两只小鼠失明的基因后，经全基因组测序发现小鼠体内有超过1500个单核苷酸发生突变，并有百个以上的位点发生发生了大片段的缺失和插入。
WGS SNVs及WGS indels 表示使用全基因组范围内检测到的脱靶突变；Exon SNVs及exon indels表示使用外显子区域检测到的脱靶突变。它们所检测到的突变数量相差巨大。
StephenTsang博士（哥伦比亚大学医学中心/人类营养研究所眼科学、病理和细胞生物学副教授）作为该文章的重要作者之一，他表示CRISPR 脱靶效应导致的基因突变所产生的潜在危害是至关重要的，这些突变包括单核苷酸突变以及基因组非编码区产生的突变。
而且研究人员一般并不会使用全基因组测序手段去检测脱靶效应导致的基因突变位点，并且可能忽视了潜在的重要突变位点，因为即便是单碱基突变也有可能造成较大的影响。
Stephen Tsang博士
StephenTsang博士希望他们的研究能够鼓励其它研究人员使用全基因组测序技术去检测使用CRISPR技术所致的突变位点，以开发出更加安全和精准的基因编辑技术。
理性的来说，这篇简短的通信文章，其初衷本就是引发讨论而非盖棺定论，在更多证据出来之前，我们并不能一棒子打死，轻率地说CRISPR-Cas9有着严重缺陷。毕竟科学的本质就在于不断地质疑与讨论，既然是质疑，就存在合理亦或是不那么合理。
如何规避“脱靶”风险
在CRISPR系列的基因编辑系统中，Cas9酶是一个非常关键的组成部分，更是“元老级”的成员，但是CRISPR/Cas9的脱靶效应是一直急需攻克的难题。在CRISPR技术向医学临床不断转化的过程中，科学家们正想法设法的解决这一重大技术难题，希望形成更精准的基因编辑系统。
近日，《Nature Methods》同时刊登的两篇研究中，发表了两种分析CRISPR/Cas9基因组编辑脱靶效应的新方法。其中一种方法可以鉴定细胞类型特异性SNP相关的脱靶突变，另一种则可以检测潜在脱靶切割位点。
在此之前，在全基因组范围鉴定脱靶效应的细胞方法也时有报道，但这些方法可能错过低频率的脱靶突变，而且高效转染的要求也限制了其应用。相比之下，体外筛查策略则具有一定的优势。它不需要高效转染，避免了细胞适应性的影响。此外，活性核酸酶的浓度可以尽可能高，将低频率突变一网打尽。
第一项研究：来自麻省总医院（MGH）和哈佛大学的研究人员开发了一种新的体外筛查方法CIRCLE-seq，该方法是一种高度灵敏的体外筛查法，比现有识别CRISPR/Cas9全基因组脱靶突变的细胞学或生化方法更有效，表现更佳。
为了检测新方法的灵敏性，研究人员将靶向HBB基因的sgRNA的脱靶结果与利用另一种方法Digenome-seq识别的脱靶结果进行比较。结果发现CIRCLE-seq 鉴定出Digenome-seq已检测到的29个位点中的26个，并且还检测到156个其他方法无法检测的新位点。
研究人员表示，与Digenome-seq检测到的结果相比，CIRCLE-seq具有更高的信噪比，而且使用的测序reads减少了一百倍，这可能是由于该技术在识别全基因组范围脱靶位点方面具有更高的灵敏度。
Caribou Biosciences 公司 CEO Rachel Haurwitz
第二项研究：在同一期的杂志上，CaribouBiosciences和DuPont Pioneer的研究人员介绍了另一种名为SITE-Seq的生化方法，它利用通过向导RNA编程的Cas9来鉴定基因组内的切割位点。该技术使用了sgRNA 编程的Cas9对基因组DNA中的剪切位点序列进行识别。
研究人员表示：“我们使用 SITE-Seq检测靶向人类基因组的sgRNA与Cas9的特异性。识别的位点数量依赖于sgRNA序列和核苷酸浓度。低浓度条件下鉴定到的位点更有可能是细胞中的脱靶突变。细胞中具有活性的脱靶位点会受到sgRNP传递、细胞类型和在核苷酸环境接触的持续时间影响。
总而言之，我们的结果强调了在评估核苷酸活性和特异性时，将全面的脱靶位点生化识别方法与基于细胞的活性检测方法结合的有效性。”
SITE-Seq过程包括了选择性的标记、富集、测序，以及将将切割后的基因组 DNA 与对应的参考基因组比对。最终比对结果中，sgRNP切割产生的位点会生成一个特殊的信号，可以通过计算检测，研究人员还表示，这个信号与Digenome-seq检测到的信号相似。
除此之外，在Cas9消化处理的人类胚肾基因组 DNA 中也检测了该方法，结果发现SITE-Seq靶向的 771 个生化切割位点。研究人员接下来将 AAVS1 sgRNA 转染到稳定表达Cas9–GFP的HEK293细胞中，3 天后进行脱靶编辑。他们从最初的 771 个包含大范围核苷酸替换的位点中选择了68个位点进行评估，发现29个细胞脱靶位点的突变频率在0.1%-66.6%。
对此，CaribouBiosciences 公司 CEO Rachel Haurwitz 表示：“通过向研究人员提供一种精确定位CRISPR-Cas 活性的基因组区域，我们可以选择活性和特性行最高的靶点来减少脱靶效应的发生，从而使CRISPR-Cas9成为一种安全且有效的基因编辑工具。”
其实在CRISPR-Cas9问世之初，大家就认识到存在脱靶效应的存在，如果克服了这一难题，那么CRISPR技术用于人类治疗的安全性就能得到很大的提高。由此我们可以知道，在保持CRISPR技术优势的基础上，努力突破其限制壁垒将是未来几年基因编辑技术发展的大趋势。
参考出处：
doi:10.1038/nmeth.4293
doi:10.1038/nmeth.4278
doi:10.1038/nmeth.4284
http://www.genetics.org/content/188/4/773
http://www.cell.com/trends/biotechnology/pdf/S0167-7799(13)00087-5.pdf
https://www.eurekalert.org/pub_releases/2017-05/cumc-cge052617.php
http://www.sci-news.com/genetics/crispr-cas9-mutations-04903.html
http://newatlas.com/crispr-gene-editing-causes-mutations/49762/
https://phys.org/news/2017-05-crispr-gene-hundreds-unintended-mutations.html
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