上海交大宋阳团队《ACS Nano》：液-液相分离型肽基荧光探针的设计及其在肿瘤细胞中的凝聚诱导发光机制

【背景概述、研究问题及意义】

凝聚现象是指水溶性生物大分子在临界浓度以上自发浓缩、最终从水中析出形成乳液滴的现象。该现象的物理本质是生物分子之间通过缔合作用而形成相分离的水/水型乳液，从而参与构成细胞内的无膜细胞器、核仁等重要细胞液态结构单元的构建。细胞中的凝聚体通常是由固有无序蛋白与RNA复合而成。这类复合物能感受外界环境的刺激，发生动态可逆的相变，从而传导生物信号、形成胞内隔室、加速生物催化反应、调控细胞周期和基因表达。

基于相分离原理的智能凝胶设计及其生物医学应用已获得广泛关注。这类相分离材料往往具有较高的分子量，从而易于克服液-液相分离过程中因熵变造成的热力学能障。然而相分离聚合物的高分子量特征也使其较难进入活细胞中，限制其作为胞内探针、疫苗/药物递送载体、基因编辑工具的应用潜力。此外，天然相分离肽大多缺少稳定的荧光发色基团，无法满足生物显影、光诊疗等实际应用需求。

【研究内容】

针对以上问题，上海交大材料学院宋阳副教授团队基于天然相分离肽（Phase-separating Peptides）的液-液相分离原理，仿照T细胞膜信号通过凝聚机制（coacervation）实现胞内信号传递放大的过程，构建出一种低细胞毒性、可长效监测肿瘤细胞内RNA水平的相分离型荧光短肽探针，为肿瘤细胞RNA的标记显影、有效检测提供了新思路。研究团队将具有聚集诱导发光（AIE）效应的荧光剂与相分离肽的重复片段(RRASL)_n进行偶联，获得荧光相分离短肽探针。该探针与RNA结合后，形成稳定发光的液滴状凝聚体（图1）。相比于天然凝聚体，AIE荧光基团的引入增强了探针之间的阳离子-π共轭作用，不仅使凝聚相变发生的最低临界浓度下降了一个数量级以上，而且在近生理盐溶液中表现出更好的物相稳定性（图3）。随着相分离肽的重复单元数n的增加，探针的自发荧光（噪音信号）逐渐消失；而当短肽探针与RNA结合后，AIE单元在凝聚体形成的分子浓缩过程中获得发光增强。实验发现，随着环境中RNA的浓度升高，凝聚体的荧光强度也逐渐增加，最大荧光增强倍率可达700倍。当RNA过量导致类凝胶形成后，探针分子无法进一步浓缩，因此荧光强度也不再继续增加。这种依赖凝聚体形成的发光效应被命名为凝聚诱导发光效应（coacervation-induced emission，CIE），是对已知固态聚集颗粒AIE效应在液态凝聚状态下的补充解释。

图1荧光相分离短肽探针的构建（a）RNA结合型相分离肽片段与四苯乙烯偶联的分子示意图；（b）凝聚体液滴融合过程的明场及荧光显微镜照片；（c）利用浊度变化测试凝聚相变发生时的最低临界多肽浓度（以浊度的转折点作为相分离的起始点）；（d）随RNA含量升高，探针与RNA的凝聚作用诱导实现荧光增强。（e）CIE荧光增强的量化。

随后，研究团队将这种荧光相分离短肽探针用于肿瘤细胞RNA的标记显影。发现该荧光相分离肽短肽探针可高效地穿膜进入胆囊癌SGC-996细胞中，并与商业化的活细胞核酸染料SYTO15形成胞内共定位。通过使用不同的穿膜抑制剂阻断穿膜过程，发现其穿膜机制与脂阀的运载相关。与已知的商业化小分子核酸探针（SYTO13、DAPI、Hoechst等探针等）相比，相分离短肽探针具有更低的细胞毒性，可更有效地支持肿瘤细胞核酸表达水平的长时间观测（图2）。

该项工作以“AIEgen-Conjugated Phase-Separating Peptides Illuminate Intracellular RNA through Coacervation-Induced Emission” 为题在《ACS Nano》期刊上发表。相分离肽荧光探针的开发及测试由国内相关交叉学科领域青年科研工作者组成的科研团队联合完成，上海交大材料学院宋阳副教授为论文第一通讯作者，博士研究生杨石为该论文的第一作者；青岛大学药学院马庆明教授、复旦大学胆道工程中心昝睿为该论文的共同通讯作者。研究课题得到了上海市浦江学者项目 (20PJ1405100), 上海自然科学基金 (23ZR1433100)和上海交大科研启动基金的支持。

图 2 荧光相分离肽探针用于胆囊癌细胞SGC-996的胞内RNA显影。（a）示意图；（b）商业化的活细胞染料SYTO13与肿瘤细胞结合后的照片（c）相分离探针（蓝色）进入肿瘤细胞后可与商业化染料实现荧光共定位。（d）CCK-8测试荧光相分离肽探针的细胞毒性；（e）荧光相分离肽探针与已知商业化探针的细胞毒性对比(t=24小时)。（f）穿膜机制研究显示MβCD可抑制相分离肽的穿膜，提示该穿膜机制与脂阀运输有关。

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论文链接：
https://pubs.acs.org/doi/full/10.1021/acsnano.2c12072

来源：高分子科学前沿

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