Molecular Ecology Resources | 耶拿大学改良扩增子测序提升微生物组多样性研究！

随着我们对各种系统的理解被带入共生微生物体的结构和作用的背景下，生物学目前正在经历一场革命。这种转变是越来越多的研究以表征与各种非生物或生物系统相关的微生物群落的结果（Microbiome | 德国慕尼黑亥姆霍兹中心重新定义微生物组：旧概念和新挑战！（附视频））。例如，微生物群落的重要作用已经在生物技术转化和动植物健康和适应性等不同系统中被揭示出来（Nature Reviews Microbiology | 植物-微生物互作：从群落组装到植物健康）。为此，许多研究依赖于系统发育信息基因组位点的扩增子测序揭示微生物群落信息（Nature | 年度重磅合集：植物微生物组！）。然后将这些信息与特定的实验参数、宿主表型或性能测量数据相关联。微生物组通常包括来自所有生命界的物种。这些微生物与环境相互作用，并通过直接关联或通过宿主间接影响对方（Nature Microbiology | 微生物组创新，实现可持续发展的未来！）。为了探究这些相互作用、模拟微生物群落动态并确定重要微生物，需要采用强大的系统方法，以高通量的方式广泛深入地覆盖多样性（Nature Protocols | 白洋和Schulze-Lefert团队建立植物根部细菌的高通量培养和鉴定方法！Nature Protocols | 密歇根州立大学何胜阳/Tiedje团队建立拟南芥微生物组研究的标准化生长体系！）。

国际权威学术期刊Molecular Ecology Resources发表了德国耶拿大学Matthew T. Agler团队的最新相关研究成果，题为Obtaining deeper insights into microbiome diversity using a simple method to block host and nontargets in amplicon sequencing的研究论文。

分析不同的微生物组正在彻底改变我们对生物机制和生态相关问题的理解，包括有机体（宿主+微生物组）组装、功能和适应。因此，多个保守的、具有系统发育信息的基因座扩增子测序已成为许多研究人员的工具。然而，许多系统的研究受到了阻碍，因为重要的测序深度可能会因为来自宿主或过多微生物的非目标DNA的扩增而丧失。本研究介绍了"blocking oligos"，这是一种低成本和灵活的方法，使用标准的寡核苷酸来阻断各种非目标的扩增，并使用软件来帮助其设计。本研究主要将其应用于植物叶片，因为叶片中普遍存在宿主扩增的特殊挑战。拟南芥特异性阻断寡核苷酸应用于八个不同的目标位点，可减少高达90%的不良宿主扩增。为了扩大适用性，科研人员设计了通用的16S和18S rRNA基因植物阻断寡核苷酸，用于在不同的植物物种中保守的目标，并证明它们有效地阻断了来自五个单子叶植物和双子叶植物的五个物种。这些可以增加alpha多样性的发现，而不偏离beta多样性模式，并且不损害植物来源的16S rRNA基因扩增子测序数据中固有的微生物负载信息。最后，本研究设计并测试了阻断寡核苷酸，以避免扩增一种病原卵菌的18S rRNA基因，证明了它们在植物以外的应用中的有效性。利用这些工具，科研人员根据针对细菌、真菌、卵菌和其他真核微生物的8个位点，完成了拟南芥叶片微生物组的研究，并讨论了描述叶片微生物组的常用扩增子测序区域的互补性。这种方法有可能通过使扩增子测序更有针对性，使各种研究系统中的问题更容易解决，从而对微生物的发现有更深入的、基于系统的了解。为了在其他研究系统中快速和容易地设计任何非目标DNA的阻断寡核苷酸，本研究开发了一个公开可用的R软件包。

图1. 一种减少扩增子测序中非目标扩增的策略

图2. 通过扩增子测序可重现且准确地表征细菌、真菌和卵菌的模拟群落

图3. 通用阻断寡核苷酸成功阻断不需要的序列，从而增加测序深度

图4. 阻断寡核苷酸的使用增加了回收细菌α多样性

图5. 细菌序列的数量可用于获得定量的微生物负载信息

图6. 通过针对真核和原核微生物的八个基因座的平行扩增子测序揭示了高度多样化的拟南芥叶片微生物组的全面概述

图7. 当输入拟南芥 ITS1序列（非目标）和UNITE真菌ITS数据库（目标）时，R包AmpStop的输出示例

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