细胞的诺亚方舟—— 清华大学陈国强教授课题组在可注射支架和组织工程领域取得新进展

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组织工程支架（Tissue engineering scaffolds）在组织医学和干细胞治疗中发挥着关键作用。采用传统手术进行的支架移植常伴随着大型开放式手术和术后感染等问题，直接影响患者生活。微创手术具有减少患者痛苦，操作方便，提高临床安全性等优势，近年来迅速发展。以聚合物水凝胶和微球为代表的可注射生物材料是目前最佳的微创手术使用的细胞载体。但大部分水凝胶是一种流体填充剂，缺少细胞生长所需的三维空间。而传统的聚合物微球的表面光滑，也没有为细胞增殖提供足够的内部空间。进行注射操作时，包埋或附着在水凝胶中或微球表面的细胞将面对不同的压力和摩擦，这些伤害可诱导细胞破裂或凋亡，降低细胞治疗的效果。

针对上述困难，清华大学的陈国强教授团队利用生物材料聚羟基脂肪酸酯（Polyhydroxyalkanoate, PHA）和气-水乳化技术（gas-in-oil-in-water double emulsion），设计出一种直径为300–360 μm的可注射开放式多孔微球（Open porous microsphere, OPM），可作为细胞生长和运输的微载体（microcarrier）。PHA-OPM具备了PHA良好的生物相容性、微球的可注射性和组织工程支架的开放式三维空间结构的三重优势，是一种特殊的球状的三维培养载体。其特殊的开放式多孔结构能在体外培养时帮助细胞向内生长；在注射运输过程中起到支撑作用，保护微球内部的细胞免于挤压和摩擦；并能实现动物体内释放细胞和组织修复的目的（图1）。由于PHA-OPM的操作原理和治疗目和圣经中诺亚方舟（躲避灾害将生命的火种运输到新大陆）的故事很相似，所以PHA-OPM也被形象地称为细胞的微型诺亚方舟（Micro-Noah's Ark for cells）。该成果有望为再生医学、微创手术及干细胞治疗提供一种新的工具。

图1. 细胞的微型诺亚方舟——聚羟基脂肪酸酯开放式多孔微球（PHA-OPM）及其的治疗方法

通过接种人来源的骨髓间充质干细胞（hMSC），该团队发现PHA-OPM 的细胞接种率高达93.4%,远高于传统微球（PHA-HM）；在10天的体外培养测试中，接种于PHA-OPM细胞能持续增长，而对照组PHA-HM的细胞培养至第7天出现大量凋亡，甚至细胞死亡的现象（图2a）。通过激光共聚焦显微镜等结果证实：待细胞生长至7天时，传统微球表面的空间已经完全被占用，无法满足细胞进一步生长的需求，而PHA-OPM还可提供大量的内部三维空间，有利于细胞的扩展和迁移（图2b-e）。

图2. PHA-OPM与传统微球PHA-HM的细胞增殖实验对比

通过该团队自创的魏氏冷冻有序切割法（WEI Frozen Orderly Section）和三维重塑技术，可清晰地观察细胞从PHA-OPM表面向内部迁移的过程（图3）。

图3. 细胞在PHA-OPM的表面分布及向内部迁移的过程

该团队还进一步证实，PHA-OPM的开放多孔结构可显著保护大部分细胞免于注射时产生的压力和摩擦；也直接影响干细胞细胞定向分化和组织修复等结果。进行hMSC异体成骨修复测试，利用PHA-OPM为载体的实验组效果远优于其他对照组（图4）。每一个PHA-OPM如同一个小小的诺亚方舟，负载大量的具有功能的干细胞进行组织修复工作。

图4. 基于PHA-OPM及对照组的异体成骨修复测试

除了先进的开放式多孔结构，PHA-OPM还具有材料的优势。PHA是一种由微生物合成的纯天然生物材料，具有良好的生物相容性和生物可降解能力，是一种潜在的医学组织工程材料。陈国强团队一直从事PHA的微生物合成及应用研究，其研究成果已代谢工程、生物塑料、再生医学与组织工程、药物化学、太空医学等领域发表多项成果（见参考文献）。大量研究表明，PHA的生物相容性优于PLA为代表的其他聚酯材料。主要原因在于，PLA的主要降解产物乳酸为酸性的小分子物质，大量释放将影响细胞的生长，而PHA的主要降解产物3-羟基丁酸（3-hydroxybutyrate，3HB）的酸性远小于乳酸，具有更小的细胞刺激性，且一定浓度的3HB对细胞活性有促进作用。因此，采用PLA制备的相似结构的开放式多孔微球（PLA-OPM），不论是细胞增殖、体外定向分化还是组织修复都不及PHA-OPM效果显著（图5）。