香港中文大学边黎明教授课题组《Nano Letters》: 纳米复合水凝胶调控细胞行为

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开发仿生多功能生物材料来模拟细胞微观环境，对于组织工程，疾病建模，仿生纳米药物和干细胞生物学等各种研究领域的进展具有重要作用。其中刺激响应型（Stimuli-responsive)的生物材料是最为广泛发展之一，如在特定的时间和位置精确地呈现各种活性配体，达致调控细胞的行为，包括粘附，扩散，机械传感和分化等。近年不少研究报导证明能通过光控、磁控、生物化学控等外界刺激策略来短暂或可逆地控制(ON-OFF机制)细胞-材料相互作用，而其基理一般是依靠活性配体与生物材料断开和重建相互作用(共价或非共价键合)，或是消除活性配体的笼子(Cage)以达到配体的呈现。然而，很少研究集中在利生物材料的宏观支架作为一个可磁控的动态笼子(Dynamic Cage)结构来操纵配体呈递的独特方法，其设计有利于提高生物材料的体内植入。

针对上述问题，边黎明教授团队开发了一种磁控纳米复合水凝胶，通过结合戴有粘附配体(RGD)的磁性纳米颗粒(Fe₃O₄, RGD-MNP)和软质(2.31 ± 0.91 kPa)透明质酸(HA)水凝胶而组成的基质，以调节人类干细胞(hMSCs)的粘附、迁移和分化（方案1），该团队将该平台命名为MagTrigel (Magnetically Triggered dynamic ligand-presenting hydrogel)。他们假设MagTrigel于向上的磁性吸引增强了RGD配体的呈现（“EXPOSED”），从而产生了细胞粘附表面，从而增强了hMSC的整合素相联的机械感测（方案1A），而向下磁性吸引使水凝胶网络能够掩盖RGD-MNP（“HIDDEN”）并抑制细胞的整合素相联的机械感测（方案1B）。

方案1 特定磁场方向吸引力调节MagTrigel 与hMSCs的相互作用和机械传感的示意图。(A) 向上的磁性吸引“EXPODED”状态 (B) 向下的磁性吸引“HIDDEN”状态 (C) MagTrigel 的详细化学结构。

图1 通过操纵方向性磁引力来控制在MagTrigel上的细胞进行循环的粘附和脱离。(A) 细胞培养在（i）“EXPOSED”或 (ii) “HIDDEN”上的粘着斑相关蛋白的荧光染色图（vinculin绿色），（F-actin红色）其细胞行为是循环可逆。(B)针对细胞粘附、铺展和机械感测是相关蛋白（YAP）荧光核定位比率的统计分析。

该团队进一步证明，MagTrigel可以在多个周期（16个周期，图1B）“暴露”和“隐藏”条件之间的循环切换，使hMSC在软质MagTrigel上的粘附着和脱离。而，硬质（Sitff，10.2±1.16 kPa）的MagTrigel无法提供水凝胶有足够的变形能力令RGD-MNP被HA水凝胶的三维网络结构笼罩。他们更发现MagTrigel同时能影响细胞的迁移行为（图2），若给MagTrigel放置一个横向磁场吸引力，细胞会往磁场相反方向迁移，其原因可能是被磁场吸引的RGD-MNP对MagTrigel的局部拉扯降低了HA结构网路的系绳顺应性（Tether Compliance，图2Bv），导致细胞偏好迁移在相应的系绳顺应性位置上在，但细胞在其他状态则没有特向异性迁移行为。于诱导干细胞分化方面，MagTrigel在持续的“暴露”状态下使hMSC有更良好的整合素介导的机械转导信号，促进其成骨分化；而持续的“HIDDEN”状态抑制hMSC的整合素介导的机械转导信号，抑制其分化及更有可能是促进了去分化（Dedifferentiation ，干细胞标记如Nanog的基因表达有上升趋势）（图3）。当中更令人感兴趣的研究结果表明，交替方向（每天更换）的磁力吸引诱导了hMSC的循环分化（“EXPOSED”）和去分（“HIDDEN”），更惊人地促进了hMSC的各种分化结果（成骨和成脂分化）。根据以前的研究表明，干细胞经过多次分化及去分化处理后，由于该细胞带有相关表观遗传记忆（epigenetics memory)，增强了其诱导分化潜能。因此这些发现表明，边黎明团队演示MagTrigel能通过各向磁控调节的纳米级RGD的动态呈现，并为研究干细胞的机械传感分化提供了一种多功能工具。

图2。（A，利用SiR-肌动蛋白和Hoechst染色以监测单细胞迁移。）（B，i–iv）玫瑰图显示细胞迁移方向和速度（B，v）在横向磁引力作用下。下，RGD-MNP使MagTrigel局部系绳顺应性产生相反方向的差异。

图3。（A）针对碱性磷酸酶（ALP），RUNX2，oil Red O和PPARγ进行染色，以分析具有不同的磁力方向吸引切换对 hMSC的诱导成骨成脂分化的影响（B）定量ALP和油红O阳性细胞（C）量化RUNX2和PPARγ的核聚集（D）ALP，RUNX2，PPARγ和NanoG的相对基因表达水平的量化。

总体而言这种仿生方法为利用整体生物材料的三维网路结构中的物理空间位阻提供了一种新概念，作为宏观笼蔽结构，以方向性磁引力触发生物活性配体暴露/隐藏由的动态呈现。由于HA水凝胶和Fe₃O₄纳米颗粒均已被广泛评估用于临床应用，因此该团队的MagTrigel在体内应用中具有一定的潜力。另外，磁场是用于各种医疗用途的安全且穿透组织的物理辐射，MagTrigel为细胞再生医学工程上提供了一种简单而通用的新平台。 

以上相关成果发表在Nano Letters（Nano Lett. 2020, 20, 5, 3207-3216）上。论文的第一作者为该团队的博士后王兆康，通讯作者为边黎明教授。

论文链接：

https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.nanolett.9b05315

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