东华大学洪枫教授团队《CEJ》：丝光处理细菌纳米纤维素管以调控小口径人工血管的尺寸和性能

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近日，东华大学洪枫教授团队利用浓碱处理技术，使细菌纳米纤维素（Bacterial nanocellulose，BNC）小径管发生丝光化反应（Mercerization）制备了丝光化BNC管（Mercerized BNC，MBNC），成功降低了BNC管的壁厚，提升了力学性能，实现了BNC管的尺寸可调控，并通过血液、细胞和SD大鼠腹主动脉移植实验等研究详细评价了该丝光化BNC管作为小径人工血管的潜力。该成果以Mercerization of Tubular Bacterial Nanocellulose for Control of the Size and Performance of Small-caliber Vascular Grafts为题，发表于Chemical Engineering Journal上。

图1. 文章设计概念图

该方法利用浓碱溶液处理管状BNC材料，国际上首次实现了对管状BNC材料的尺寸控制，有效调节了BNC管的体积和壁厚。并且，该工艺具有BNC处理时间短、效率高、工序简单、简洁方便等优势。

图2. 丝光化BNC管的制备和宏观形态：（A）丝光化处理过程；（B）不同浓度NaOH溶液处理后BNC管的外观；（C）丝光化处理前的BNC管；（D）内部有支撑和无支撑的MBNC管；（E）去除内部支撑后的MBNC管（包括有内部支撑和无内部支撑的MBNC管）。

据世界卫生组织年度报告可知，心血管疾病（Cardiovascular diseases，CVD）已超过癌症成为人类死亡的首要疾病。目前，血管移植手术在CVD的治疗中具有重要地位，自体血管移植是该类手术的最佳选择，但是自体血管供体来源有限以及取材手术易造成二次创伤，限制了该方法的临床使用。因此，人工血管植入成为另一种治疗方式。在中大口径人工血管（内径大于等于6 mm）方面，膨体聚四氟乙烯和涤纶聚酯等合成聚合物已被广泛应用，但是当它们应用于小口径人工血管时（内径小于6 mm），却由于急性血栓形成、组织增生等问题导致远期通畅率低，致使迄今为止没有一款小口径人工血管市售产品。因此，具有长期畅通率的小口径人工血管的制备依旧是是目前研究的重点和难点。

BNC由于独特的纳米级三维网络结构、形态可控性以及良好生物相容性，被认为在小口径人工血管领域具有优良的应用潜力。但是BNC高含水时的机械性能弱、缺乏顺应性，以及过厚的管壁不利于手术缝合，限制了应用。因此，管状BNC性能的提高对改善其作为小口径人工血管的移植效果具有重要意义。

针对以上问题，东华大学洪枫教授团队设计开发了一种碱缩细菌纳米纤维素管的制备技术（发明专利CN109880140A和CN109912828A），通过将BNC管浸入到浓碱溶液中并加以内部支撑，调节浓碱处理的时间和温度来调控BNC管的壁厚和尺寸，制备出丝光化BNC管，以改善BNC管的力学性能和管壁过厚的情况。

在最近的报道中，研究人员通过此技术调节了BNC管的尺寸，缩小了BNC管的壁厚，调控了BNC管的纤维结构。研究表明，当碱浓度高于10%时，MBNC的结晶度发生明显的降低，纤维形态发生缠结；纤维直径统计结果显示，丝光化后MBNC管的纤维直径明显变粗；原子力显微镜结果表明MBNC管具有更光滑的内腔表面（图3）。

图3. （A）不同MBNC管内表面与外表面的FE-SEM图和纤维分布（黄色虚线框内的放大倍数为20000倍）；（B）不同MBNC管内表面的AFM图。

图4为浓碱处理后BNC管的理化性能。除纤维结构发生改变外，浓碱处理后的BNC仍为纯纤维素，但是其结晶度明显下降；MBNC管较BNC管具有更高的杨氏模量、径向拉力和爆破压，以及更低的水渗透率，力学性能明显提高，且14天内无明显变化，十分稳定。

图4. 原始BNC和MBNC管的理化性能：（A）结晶度；（B）红外光谱；（C）氮气吸附-解吸曲线；（D）应力-应变曲线。原始BNC和MBNC导管在PBS溶液中第1天和第14天的机械性能：（E）轴向杨氏模量；（F）径向拉伸强度；（G）爆破压；（H）水渗透量；（I）缝合强力。* p<0.05；** p<0.01；#p>0.05。

由于MBNC管比表面积的降低和内腔粗糙度的下降，MBNC管的蛋白吸附量明显减少，血小板粘附量明显减少；与市售的中大口径ePTFE血管相比，血浆复钙时间得以延长，血液相容性明显提高。除此以外，通过活细胞荧光染色和电镜观察可知，MBNC管具有良好的内皮细胞相容性（图5）。

图5. （A）蛋白质吸附实验；（B）溶血率；（C）血浆复钙动力曲线；（D）全血凝固时间测定；（E）原始BNC管和MBNC管上的血小板粘附情况；（F）培养1、3和5天后，管腔表面上HUVEC的荧光照片；（G）培养1、3和5天后管腔表面HUVEC的FE-SEM图（放大倍率为1000倍）。** p<0.01。

该研究利用SD大鼠腹主动脉移植实验对MBNC-20管的远期通畅率进行评估，多普勒彩超结果表明（图6A），在血管移植16周后移植部位的血流通畅，证明MBNC管具有较好的远期通畅性；免疫荧光染色结果表明，MBNC-20管的内壁形成了完整的内皮层（CD31，红色，图6B）且管腔内表面有平滑肌层生成（α-SMA，绿色，图6B），同时MBNC-20的H&E染色和Masson染色结果（图6C）也印证了免疫荧光染色的结果。以上结果均表明MBNC管在小口径人工血管领域具有良好的应用前景。

图6. （A）MBNC-20管植入后1-16周后的多普勒彩超分析；MBNC-20植入5个月后的切片观察：（B）免疫荧光染色（CD31：红色；α-SMA：绿色）、（C）Masson染色和（D）H&E染色（a₁-d₁中虚线框位置的放大图依次展示在a₂-d₂和a₃-d₃中)。

论文第一作者为东华大学化学化工与生物工程学院博士生胡高铨，通讯作者为细菌纳米纤维制造及复合技术科研基地的洪枫教授。该研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和东华大学博士研究生创新基金的资助。

全文下载链接：

https://doi.org/10.1016/j.cej.2021.131104

该研究团队长期从事细菌纤维素的低成本高效制备及其高附加值医学应用研究（https://www.researchgate.net/profile/Feng_Hong2），包括在细菌纤维素基小口径人工血管、神经导管、止血海绵、新型功能敷料等生物医学领域开展了大量工作。

该团队在BNC基小口径人工血管研究领域已展开广泛的研究并取得了一系列成果，在国际上首次提出并构建了“双硅胶管”生物反应器用于高效生产一体化管状BNC材料¹，评估了不同培养条件对BNC管的结构和性能的影响²，并详细比较了国内外三种生物反应器所得BNC管的结构和性能差异³；该团队分别在力学性能、抗凝特性和生物活性等方面对BNC管进行改进，制备了BNC/PVA^4，5、肝素化BNC/壳聚糖^6，7、BNC/明胶⁸等一系列复合管，提升了BNC应用于小口径人工血管的潜力。除以上成果外，该团队还率先在国际上评价了风干细菌纤维素小径管在兔颈动脉模型中的替换应用情况⁹；利用液体施压技术制备了负载丝素蛋白纳米颗粒的BNC复合管，提升了BNC管的抗凝特性，促进了内皮细胞的增殖，抑制了平滑肌细胞的生长¹⁰。

参考文献：

1. Preliminary study on biosynthesis of bacterial nanocellulose tubes in a novel double-silicone-tube bioreactor for potential vascular prosthesis. BioMed Research International, 2015, 2015, 560365.

2. Comparison of two types of bioreactors for synthesis of bacterial nanocellulose tubes as potential medical prostheses including artificial blood vessels. Journal of Chemical Technology & Biotechnology, 2017, 92, 1218-1228.

3. Physicochemical properties and in vitro biocompatibility of three bacterial nanocellulose conduits for blood vessel applications. Carbohydrate Polymers, 2020, 239, 116246.

4. Potential of PVA-doped bacterial nano-cellulose tubular composites for artificial blood vessels. Journal of Materials Chemistry B, 2015, 3, 8537-8547.

5. 细菌纳米纤维素/聚乙烯醇小径人工血管的制备及其表征. 中国组织工程研究, 2017, 21(34), 5474-5480.

6. Performance improvements of the BNC tubes from unique double-silicone-tube bioreactors by introducing chitosan and heparin for application as small-diameter artificial blood vessels. Carbohydrate Polymers, 2017, 178, 394-405.

7. 细菌纳米纤维素/壳聚糖复合管制备及其作为小径人工血管潜力的评价. 中国组织工程研究，2017，21(34), 5467-5473.

8. 肝素/鱼源明胶改性细菌纳米纤维素管用于小口径人工血管的潜力. 纤维素科学与技术, 2019, 27(2), 1-10.

9. Implantation of air-dried bacterial nanocellulose conduits in a small-caliber vascular prosthesis rabbit model. Materials Science & Engineering C, 2021, 122, 111922

10. Improved performance of bacterial nanocellulose conduits by the introduction of silk fibroin nanoparticles and heparin for small-caliber vascular graft applications. Biomacromolecules, 2021, 22(2), 353-364.

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