麦吉尔大学李剑宇和Luc Mongeau团队Adv. Sci.：能承受百万次高频力学加载、细胞兼容、可注射的多孔双网络水凝胶
生物组织的正常工作，需要良好的力学性能和血液循环。具体的例子包括跳动的心脏和伸缩的肌肉。可注射水凝胶因其简单、易用、微创等特性，是治疗受损组织的首选材料。但是，可注射水凝胶的临床应用受制于两大难点。第一，常用的水凝胶内部的孔径在10纳米量级，这么小的孔径阻碍血液及养分的快速输运；超过1-3 毫米的凝胶，若无血管化，难以保障深层细胞的存活。快速血管化难以在可注射水凝胶中实现，因此现有材料难以应用于厘米级别以上的组织和器官。第二，现有可注射水凝胶的断裂韧性普遍偏低，难以胜任一些活动部位软组织的修复。比如人类的声带在工作时会产生每秒上百次的高频大幅度震动，目前尚无可注射水凝胶能够经受住如此极端的机械刺激而不破裂。此外，增加水凝胶孔径可以有效促进营养渗透，但会损失机械性能。近些年开发的双网络水凝胶，大多数基于具有生物毒性的单体和反应条件，因此无法用于注射。即使是使用现有的细胞兼容的双网络水凝胶配方也无法解决水凝胶渗透率低的问题。
针对以上问题，加拿大麦吉尔大学的李剑宇和Luc Mongeau教授团队首次提出利用分步交联和微分相行为，创造出细胞兼容、可注射、可浇灌的多孔双网络水凝胶（Porous double-network hydrogels, 简称PDN）。该方法创造出的水凝胶具有细胞大小的联通的微孔，在无血管化的条件下，细胞培养基可直接穿透器官级别厚度的水凝胶来保障其中细胞的存活和生长。与此同时，该凝胶体系具有高韧性，抗疲劳，且对缺陷不敏感。在长时间高频生理机械环境刺激后保持无破损（120Hz频率下大于6百万次）。该方法首次集多孔、增韧、可注射性、细胞兼容等考量于一体，有望实现对治疗活跃软组织部位的修复，同时解锁新的生物应用的可能性。
该团队利用壳聚糖pH值从酸性到中性过程中发生微分相的特性来展示PDN合成方法。该凝胶体系由未修饰的壳聚糖（chitosan）和乙二醇壳聚糖（glycol chitosan）微酸性水溶液组成。其在室温下通过加入碳酸氢钠和乙二醛可将pH调节到中性并引入共价键交联剂，此时细胞可以安全引入前驱液中并通过针管递送。当前驱液注射到37°C环境后，溶液中未修饰的chitosan在pH提升到其pKa值（约6.5）之后会发生微分相行为并引发物理交联形成多孔的耗散网络，随后glycol chitosan会被乙二醇共价键交联，形成弹性网络。通过这种方式形成的可注射多孔双网络水凝胶具有细胞大小的孔径，其机械性能匹配软组织，且具有可媲美胶原蛋白的快速应力松弛。
图1：PDN的设计示意图，以及机械性能和多孔结构的表征。
由于形成的孔洞高度联通，PDN具有良好的渗透性（permeability）。其渗透性与一些多孔组织（比如声带和骨头）相当，且比常用的凝胶（如聚乙二醇、明胶、琼脂）的渗透性高出至少2-4个数量级。与此同时，尽管PDN包含大量的孔，其机械韧性相比单层网络的标准凝胶仍高出了8-40倍，且拉伸性也大幅提高，其机械韧性对孔不敏感。
图2：PDN的渗透性和韧性的表征。
因选取的原材料、交联方法及合成条件皆细胞兼容，因此PDN对细胞高度友好，可以作为细胞生长的支架。相对于纳米孔径的标准凝胶，PDN的多孔结构让包裹其中的成纤维细胞更好地增殖和展开。细胞在其中的迁移速率也远高于标准凝胶。
图3：PDN的细胞兼容性和促进细胞生长的能力。
该团队首先展示了PDN可以用于微流体设备来进行三维细胞培养。微流控设备如器官芯片经常用作细胞培养的装置，但大部分水凝胶在注射到微流体管道后会造成堵塞，因此一般需要通过3D打印等方式来精确控制其大小和位置，增加水凝胶技术在微流控中的应用的难度。而PDN在注射到微流体管道后，液体可以轻松穿过其多孔结构输送至整个凝胶。不同的管道还可以相互连通，模块化设计可以实现细胞共培养。整个过程简单易用，大幅降低在微流控设备中使用水凝胶的门槛。
图4：PDN在微流体装置中的应用展示
为验证该凝胶的机械和物理性质的稳定性，该团队创造了一个类声带生物反应器来模拟声带的生理机械环境。研究人员将载有人声带成纤维细胞的PDN注射到该生物反应器内，加载的细胞培养基可顺利穿透6厘米厚的水凝胶进行细胞培养。然后研究人员通过引入气流引发水凝胶每秒震动约120次，并把振幅和声压控制在人类正常发声的范围内。经过7天约120Hz下超过6百万次的机械震动，单网络的标准凝胶们都完全被震碎，但PDN保持原来形貌未受损，且机械性能没有衰减。同时，PDN在保障细胞存活和增殖的情况下，研究人员发现类声带的高频机械刺激可激发声带成纤维细胞的细胞外间质的分泌。这意味着机械性能的稳定具有增强组织再生的疗效的潜质，并且类似研究难以通过现有水凝胶体系实现。
视频1 可注射凝胶在细胞培养时经受仿声带的高频机械加载
图5：PDN在类声带长时间的极限机械环境刺激下的稳定性和生物表现。
该工作同时克服了困扰可注射水凝胶技术已久的低孔隙率和低机械韧性这两大难点，且方法可推广到多种材料体系。该技术有望用于修复活动的软组织损伤，且对组织工程、生物制造、器官芯片、药物递送、疾病模型等生物应用提供新思路。
该研究进展以Injectable, Pore-Forming, Perfusable Double-Network Hydrogels Resilient to Extreme Biomechanical Stimulations为题发表在Advanced Science。该工作的共同第一作者是麦吉尔大学机械系博士生Sareh Taheri和鲍光宇，共同通讯作者是麦吉尔大学博士生鲍光宇、加拿大研究讲席教授李剑宇、以及Luc Mongeau教授。
论文链接：
https://doi.org/10.1002/advs.202102627
李剑宇教授团队致力于新型生物材料设计开发和机理研究，目前的研究方向包括软物质力学、生物粘合剂、再生医学、止血材料、手术器械和智能设备开发。
相关前期工作包括：
首次实现生物打印细胞大小孔径且粘弹性可正交调节的水凝胶细胞支架：Guangyu Bao, et al. Triggered micropore-forming bioprinting of porous viscoelastic hydrogels, Materials Horizons, 2020
具备优异的化学稳定性、离子相容性、广谱粘接性的多功能高韧性水凝胶离子器件：Guangyu Bao, et al. Ionotronic tough adhesives with intrinsic multifunctionality, ACS Applied Materials & Interfaces, 2021
多材料生物打印：Hossein Ravanbakhsh, Vahid Karamzadeh, Guangyu Bao, et al. Emerging technologies in multi‐material bioprinting. Advanced Materials, 2021
组织粘附剂的设计和应用：Zhenwei Ma, et al. Multifaceted design and emerging applications of tissue adhesives. Advanced Materials, 2021.
高韧性水凝胶粘附涂层的设计和应用：Zhenwei Ma, et al. Bioinspired tough gel sheath for robust and versatile surface functionalization, Science Advances, 2021
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相关进展
多伦多大学刘新宇团队、麦吉尔大学李剑宇团队合作获得Materials Horizons 2020年度杰出论文奖
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