澳门大学“春明糖水”团队《Adv. Sci.》：仿淬火铸铁之法 - 无须化学修饰而打印多糖材料

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由于异物反应造成的植入失败带来每年超过100亿美元的损失。三维打印作为增材制造技术之一，是精确设计生物材料形貌、从而调节植入物异物反应的优良工具。然而，即使是对于最主流的“挤出打印”技术而言，真正“可打印”的生物材料极为有限。可惜的是，天然多糖具有与生俱来且丰富的免疫调节活性，却是通常被认为“不可打印”的材料，往往需要与其它材料共混或者进行化学修饰来实现三维打印，但这无疑会为体内活性的研究引入额外变量，并且加大了材料均一性的控制难度。那么，是否有办法可以使天然多糖材料以其原本的结构进行打印加工，使这类材料的免疫调节潜力可以真实、自然、充分地利用？ 

澳门大学王春明教授团队，联合南京大学董磊教授和解放军总医院孙晓艳教授，开发了一种非溶剂淬火（NSQ）的打印技术，破解了这一难题，使得多种多糖材料在无须化学修饰的情况下可以成功打印，且保持数月之久的稳定性。他们首先从理论分析多糖为何“不可打印”。对于挤出打印技术，挤出形成的微丝（filament）是构成三维结构的基本单位，而多糖溶液在形成微丝时，由于缺乏足够的分子间结合力来维持强度，导致微丝沉积在接收平台后，还来不及进行后续的交联固化，就在重力的作用下发生了塌陷，无法进行高度的堆积。目前的手段，也都着力于解决微丝“内部”强度不够，或者液态-胶态转变（sol-gel transition）慢的问题。

论文的第一作者、澳门大学博士生廖祯诚自幼喜欢动手给自己做玩具，尤其在家口巷尾的铁匠铺流连，偶尔捡回废弃却精巧的零件。儿时的愉快回忆让他联想到：在铸铁的过程中，包含了一道强化金属的关键步骤——淬火，通过把加热到临界温度的钢件快速进行冷却来实现表面的硬化。受此启发，他和同事决定跳出思维定式：考虑借鉴淬火过程中“由外向内”的加工方式，设想通过把每根微丝单位内部的“水”约束住，并利用“水”的力量进行支撑，来实现三维结构的构造（图1）。

图1. 儿时观察的“铸铁淬火”，启发了作者“多糖锁水”这一全新的三维打印技术

想要实现理想的“淬火”需要满足，第一，速度快，保证微丝在塌陷前就通过外部定型，锁住了内部的水；第二，微丝不能发生过度的形变。基于此，研究者考虑使用非溶剂（non-solvent）来进行淬“火”。非溶剂是与溶剂互溶，但无法溶解多糖的试剂。他们设想，当材料在非溶剂当中挤出时，非溶剂会迅速置换界面的水分子，届时，界面的多糖会处于过饱和的状态从而发生固化（quenching），从而实现“锁水”(water-locking)。为验证此假设，他们选择了5种具有不同理化性质的天然多糖，展开了对各自最适非溶剂的筛选。这里以直链葡甘聚糖（GM）为例，N,N-二甲基甲酰胺于它而言能够快速实现表面固化，同时不会导致微丝直径的过度收缩，因此可作为GM的适宜非溶剂。进一步地，研究者通过分析微丝的径向结构，观察到微丝径向上由外向内呈现出由致密到疏松多孔的结构变化，证实了“锁水”的设想（图2）。

图2. 微丝径向微观结构的变化证实“由外向内”淬火的发生

微丝质量的提升是否最终能反应在打印结构上呢？研究者以经典的栅格结构作为打印模型，发现五种天然多糖材料的形状保真度均得到显著提升。并且在这一过程中，他们还发现NSQ还具有以下特点：第一，带来了更广的打印窗口，多糖即使在较低浓度下也能完成打印；第二，支架在非溶剂中能够长时间地存放，因此增加了NSQ支架在商业以及临床应用中的潜力（图3）。

图3. 不同天然多糖传统打印以及NSQ打印效果对比；圆环结构表明支架能长期存放于非溶剂环境

最后，研究者为了证实NSQ打印支架能实现更加精确的天然免疫调节活性，将其植入到小鼠皮下进行观察，以相同体积大小的块状多糖凝胶（Bulk）、和传统打印方式进行打印的支架（CP）作对照，观察宿主的免疫反应。其中，NSQ支架加工成了微丝间距分别为1.5（NSQ-1.5）以及2.5（NSQ-2.5）的栅格结构。研究者分别从组织、细胞以及基因三个方面比较了四种支架对异物反应的影响，发现通过NSQ打印的支架具有与Bulk以及CP完全不同、且具有精确而微妙差别的免疫响应，而后两者之间没有观察到差异（图4）。其中，NSQ-1.5 对血管生成的影响更大，而 NSQ-2.5 更为直接地影响着细胞外基质的重塑。此外，在细胞受体表达、细胞因子释放和免疫细胞表型方面具有全面的差异。接下来，研究者还通过Tlr2^-/-敲除小鼠进行验证，认为Tlr2的差异性激活可能是造成上述结果的关键原因。

图4. NSQ-1.5以及NSQ-2.5的RNA测序结果

该研究的设计趣味盎然，思路新颖，既不进行化学修饰、也未与其他材料共混，而是基于“由外向内”进行淬火的思路，达到改善天然多糖材料的可打印性的目的，为相关生物材料的3D打印加工提供了与常规方法不同的思路。这一工作于本周以A “Nonsolvent Quenching” Strategy for 3D Printing of Polysaccharide Scaffolds with Immunoregulatory Accuracy 为题在线发表于Advanced Science，研究得到国家自然科学基金委员会优秀青年科学基金（港澳）、澳门科技发展基金、深圳市科创委港澳科技计划以及澳门大学发展基金会的支持。

原文链接：

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1002/advs.202203236

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