华中大臧剑锋教授团队《Bioact. Mater.》：微创生物打印实现原位肝脏再生

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器官损伤可能危及生命，全世界每年有500多万人因此死亡。自体移植和异体移植被认为是器官移植的金标准，但仍然存在许多局限性，如供体短缺、供体部位发病率和不良免疫反应。组织工程技术的发展为器官损伤的治疗提供了新的途径。原位组织再生相对简单，通过在缺陷处植入生物支架，作为人工微环境并提供结构支持，直到组织形成。然而，原位组织再生受到原位制造技术的阻碍。原位生物打印技术可在缺损伤口上直接制备支架，为原位组织再生提供了一种新的方法。然而，由于现有的原位生物制造技术(包括打印深度和生物墨水)的限制，在体内深层器官中生物打印支架仍然是一个巨大的挑战。华中科技大学臧剑锋团队在2021年首次提出将磁控软体机器人的优势应用于3D打印，结合磁场高穿透性与软材料的大变形特点，由磁场将外部路径的运动映射到具有大变形能力的软体机器人上。通过非接触式3D打印，实现磁控3D打印(Nat. Commun. 12,5072(2021))。然而，原位组织再生需要合适的生物墨水进行原位打印，打印出与缺损几何形状匹配的更复杂的打印图案，以此来实现完全占据缺损部位的解剖结构，提供微环境和结构支持。

针对上述问题，华中科技大学臧剑锋教授、华中科技大学同济医学院附属协和医院王征教授以及王琳教授团队联合在Bioactive Materials 上发表了题为“Minimally invasive bioprinting for in situ liver regeneration”的研究论文，提出了一种通过微创生物打印电活性水凝胶支架来促进原位组织再生的原位器官修复策略，通过铁磁生物打印电活性、自愈合、生物兼容、生物降解和组织粘附的水凝胶支架，以微创方式在缺陷大鼠模型中进行原位修复。利用计算机断层扫描（CT））部分肝脏切除的活体大鼠后，通过三维重建缺损，在活体大鼠的部分肝脏切除伤口处打印电活性水凝胶支架，促进细胞增殖、迁移和分化，维持肝功能，实现原位组织再生。

图1 微创生物打印电活性水凝胶支架来促进原位组织再生的示意图

用于原位组织再生的高性能生物墨水应具有与组织相似的力学和导电性，以提供有效的结构支持，促进再生过程中的细胞分化和增殖。为了获得更高水平的肝脏特异性功能和机械稳定性，作者以接枝有聚苯胺的季铵盐壳聚糖(QCSP)、壳聚糖(CS)和氧化透明质酸(OHA)为原料设计了一种与肝脏的机械和导电性能类似的，可与生物组织粘附的导电水凝胶生物墨水（图2）。此外，此导电水凝胶生物墨水具有良好的生物相容性及生物降解性，这对于执行和维持必要的细胞活动是必不可少的（图3）。

图2 用于原位肝再生的导电水凝胶生物墨水的力学和导电性能优化

图3 导电水凝胶生物墨水的生物相容性与生物降解性

生物墨水的流变性是直接墨水书写生物印刷的关键。一方面，通常希望生物墨水在高剪切速率下具有相对较低的粘度，但在低剪切速率下具有更高的粘度，这样生物墨水可以很容易地从打印喷嘴流出，但在打印后保持其形状。另一方面，生物墨水应具有自愈合性能，以承受外部机械力，延长使用寿命。此外，生物墨水应该能够形成长丝，并实现连续均匀的挤压，以实现高形状保真度。作者以接枝有聚苯胺的季铵盐壳聚糖(QCSP)、壳聚糖(CS)和氧化透明质酸(OHA)为原料制备了具有电活性、自愈合、组织粘附和可挤出的水凝胶生物墨水，并可通过调整壳聚糖浓度和交联度来调节其流变性能（图4）。

图4 导电水凝胶生物墨水的原位生物打印性能优化

此外，面对实际应用中存在的多种多样的、规则或不规则形状的三维复杂结构，通过磁控磁软导管机器人（FSCR）在极坐标系下实现复杂三维结构的打印是一个挑战。作者通过在FSCR打印机中引入了实时圆弧插补，提高直线路径打印的精度。为了评估导电生物墨水打印的保真度，作者引入了五项测试来定量分析导电生物墨水直接挤出的特征，以及利用结构的完整性来评价打印精度。经过改进后的FSCR打印机具有良好的可打印性及较高的打印精度和保真度，并在具有伤口的离体猪肝上实现了原位水凝胶支架制造（图5）。

图5 导电水凝胶生物墨水的3D打印能力和保真度。

作者最终在部分肝切除的大鼠模型中验证了微创生物打印电活性水凝胶支架来促进原位肝脏再生的可行性，在活体大鼠肝部分切除模型中打印的电活性水凝胶支架(宽8毫米，高3毫米)可以显著促进组织再生(3天内伤口闭合面积超过80%)（图6）。此电活性水凝胶支架在早期可降低肝损伤后的全身炎症水平，加速原位组织再生，维持肝功能并促进器官修复。

图6 微创铁磁生物打印用于大鼠部分肝切除模型的原位组织再生。

这种体内支架制造技术可扩展到3D打印负载细胞的组织结构，可能为原位组织再生和体内器官培养开辟了一条新的途径。

华中科技大学博士研究生杨月莹、硕士研究生于正阳、博士研究生路小欢为本文的共同第一作者，华中科技大学臧剑锋教授、华中科技大学同济医学院附属协和医院王征教授、王琳教授为共同通讯作者。

以上研究获得了国家自然科学基金面上项目、国家自然科学基金重点项目、湖北省科技创新重大基金项目、华中科技大学创新项目的资助。

论文链接：

https://doi.org/10.1016/j.bioactmat.2023.03.011

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