项目文章｜巨噬细胞衍生 sEVs 的 miRNA 转移促进神经胶质瘤干细胞前向间充质过渡
摘要
神经元到间充质转变（PMT）是胶质母细胞瘤（GBM）进展的常见过程，该过程导致放疗抗性增强。来自有丰富外泌体研究经验的山东大学齐鲁医院李刚教授研究团队发现，肿瘤相关的巨噬细胞（TAMs）通过小细胞外囊泡（sEVs）触发了胶质瘤干细胞（GSCs）中的 PMT；并将 miR-27a-3p，miR-22-3p 和 miR-221-3p 转移至 GSCs，通过靶向 CHD7 增加神经元（PN）GSCs中的几种间充质（MES）表型。另外，CHD7 在维持 PN 表型中起关键作用，敲除 CHD7 通过 RelB/P50 和 p-STAT3 途径促进 GSC中的PMT。该研究的相关成果于今年 4 月发表在影响因子为 8.619 的 Cancer Immunology Research 杂志，诺禾致源提供外泌体 miRNA 建库测序分析专业服务。
背景
胶质母细胞瘤（GBM）是成人中最普遍和致命的原发性中枢神经系统肿瘤，根据基因表达特征分为三种亚型（proneural，PN；classical，CL；mesenchymal，MES）; 其中 PN 亚型预后最佳，MES 亚型最差。不同的预后部分是由于侵略性和放疗抗性不同引起的。
胶质瘤干细胞（GSC）是神经胶质瘤内的一小部分肿瘤细胞，表现出干细胞类似的特性，因此在神经胶质瘤的形成、维持和复发以及放疗抵抗中起着重要作用。GSC 与 PN 和 MES 表型相似。PN/GSC 趋向于转变为 MES 以克服放疗引起的细胞死亡。这种从神经元到间充质转变（PMT）的过程可能是由于神经胶质瘤组织中存在大量巨噬细胞导致的。但巨噬细胞在 GSC 中驱动 PMT 的机制仍不清楚。
肿瘤相关巨噬细胞（TAM）占神经胶质瘤细胞的 30％。TAM 促进神经胶质瘤进展，导致神经胶质瘤患者预后不良。TAM 分泌小细胞外囊泡（sEVs）的能力促进了各种类型肿瘤的进展。但尚不清楚巨噬细胞源性 sEVs（MDEs）是否会加重神经胶质瘤的恶性程度，尤其是 GSCs 中的 PMT。
sEVs 直径小于 200nm、通过向受体细胞传递非编码 RNA，特别是 microRNA（miR），在细胞间通讯中发挥至关重要的作用。缺氧神经胶质瘤细胞分泌含有 miR-1246 的 sEV，以诱导巨噬细胞的 M2 表型。本研究表明巨噬细胞通过含有 miR-27a-3p，miR-22-3p 和 miR-221-3p（均靶向 CHD7）的 sEV 促进了 GSC 中的 PMT，并增强了 GSC 的抗辐射能力。
重要结果
1、 M2 巨噬细胞衍生的 sEV 诱导 GSC 中的一系列恶性表型。
正常人 PBMCs 诱导 M2 型巨噬细胞的 PCR 结果表明几种抗炎/促肿瘤的因子表达水平较高。WB 结果显示在 GSC 1-14 细胞中 CD15（PN GSCs 的表面标志物）高表达，CD44（MES 表面标志物）的含量与 MES GSC 相比较低，CD133 的含量与 GSC 8-11 细胞相当，而在 MES GSCs 上更高。在裸鼠异种移植模型中验证了 GSC 1-14 细胞的肿瘤形成能力。
对超速离心富集的 M0DEs 和 M2DEs 进行鉴定。TEM 电镜结果表明所富集到的结构为 sEVs，qNano 粒径显示所富集到的 sEVs 直径在 50-200 nm 之间，WB检 测两个阳性指标（TSG101 和 CD9）以及一个阴性指标进一步证明富集的外泌体纯度（图一）。分别将GSCs 和 MCM、MDEs 以及去除 SEVs 的 MCM 共培养，荧光标记实验确定了 GSCs 对 MDEs 的吞噬作用；肿瘤细胞成球实验和 EdU 等表明 M2DEs 显著影响 GSCs 自我更新能力和增殖。这些结果证明 M2DEs 可能会促进诱导恶性 GSC 表型。
图一
2、M2DEs 促进 PMT 以及 GSCs 的体外放射抗性。
流式分析表明，M2DEs 处理的 GSCs 中 CD44 和 YKL40（MES 型表面标志物）表达量升高，SOX2（PN 型表面标志物）表达量降低；而 M0DEs 处理的 GSCs 中并未出现该现象，说明对于 M2 型来说 PMT 诱导是特异的。
放射抗性是 MES 型 GSCs 的标志。IR 促进 GSCs 的凋亡。对不同 sEV 处理的 GSCs 测定放射敏感性，发现 M2DEs 预处理的 GSCs 对 IR 的敏感性和 G2/M 期细胞占比（反映对 IR 的敏感度）较低，表明 M2DEs 使 GSCs 的体外放射抗性增强（图二）。
3、 M2DEs 促进 PMT 以及 GSCs 的体内放射抗性。
相对于其他比较组来说，M2DEs 处理的 GSCs 生长能力更强，肿瘤侵袭更明显，且 IHC（MES 标志物）染色结果表明发生了 PMT（图 3）。放疗后 M2DEs 处理组小鼠肿瘤的体积相较于对照组来说增大，表明促进生长作用外，M2DEs 在体内有介导抗辐射的能力。另外虽然所有的小鼠在放射所用下细胞凋亡增加，但 M2DEs 处理的小鼠在异种移植的神经胶质瘤样本中显示射线诱导的凋亡减弱，表明 M2DEs 促进体内胶质瘤的生长以及抗辐射能力。
4、M2DEs 通过 miRs 调控 GSCs 的 PMT。
包含 miRs 的 sEVs 在胶质瘤-髓样细胞通讯中起关键作用。对 M2DEs 进行外泌体 miRNA 测序，筛选出 15 个上调最显著的 miRNA 并转染到 PN GSCs 中（图四）。流式检测表明转染 miR-27a-3p, miR-22-3p 和 miR-221-3p 的细胞上 CD44 的表达量显著升高；qPCR 结果对测序结果进行验证，M2DEs 中三者的表达量均上调表明与测序数据的一致性。EdU肿瘤成球实验等发现这三种 miRNA 明显增强 GSCs 的自我更新和增殖能力。另外，构建干扰载体并转染到 M2 巨噬细胞中发现抑制这三种 miRNA 的表达导致 sEVs 中表达量的降低；用 miRNA 敲除的 sEVs 处理 PN GSCs 使 M2DEs 的前 PMT 效应减弱，表明 M2DEs 通过 miRs 调控 GSCs 的 PMT。
来源于 GBM-BioDP 数据库的数据表明 MES 细胞相对于 PN 来说 miRNA 表达较高，而 TCGA 数据库中的 GBM 和 LGG 样本生存分析表明高表达的 miRNA 明显降低胶质瘤患者的生存率。
5、 CHD7 是 miRNA 促进 PMT 的直接靶基因。
通过 TargetScan 和 miRDB 预测 miRNA 的靶基因为 CHD7，TCGA 数据库显示 CHD7 在 PN 中的表达量高于 MES；r2 检验证实 CD44 和 YKL40 成负相关，与 SOX2 表达成正相关；GSEA 表明这些基因的转录本或蛋白符合与 MES 成负相关而与 PN 正相关的预期（图五）。以上研究均证明 CHD7 为 miRNA 的靶基因。
Western-blot 显示表达 miRNA 使 GSCs 细胞中 CHD7 表达量下降，而敲除 miRNA 会使其恢复正常，证实 M2DEs 通过 miRNA 调控 CHD7 表达。荧光素酶报告基因检测表明转染 miRNA 的荧光素活性降低，表明 CDH7 与 3’UTR 区的直接结合。此外，敲除 CHD7 使 MES 表面蛋白含量升高而 PN 含量下降，且与 PMT 两个明确的通路相关。因此，CHD7 作为 miRNA 的靶基因直接介导 GSCs 的 PMT。
通过流式检测发现，过表达这三种 miRNA 能够降低 GSCs 细胞的凋亡率，细胞周期分析发现捕获的处于 G2/M 期的细胞明显减少，在 M2DEs 中敲除 miRNA 会降低抗辐射能力（图六）；同样的，抑制 GSCs 细胞中三种 miRNA 表达可以削弱对辐射的抗性，提高细胞凋亡率，增大 G2/M 期的细胞占比。以上结果表明含有 miRNA 的 sEVs 在增强 GSCs 放射抗性中有重要作用。另外，敲除 CHD7 可以增强 GSCs 放射抗性，表明 M2DEs 中的 miRNA 通过靶向 CDH7 介导 GSCs 抵抗辐射。
图六
7、体内 GSCs 中 miRNA 介导的 PMT 和放射抗性通过靶向 GHD7 实现。
在分别含有过表达 miRNA 和 CHD7 干扰载体 GSCs 的裸鼠中肿瘤负荷明显增加，MES 表面标志物的含量上升，小鼠细胞的侵袭更显著；通过放射治疗后的正常 nc 组和其他组之间肿瘤体积差异增大，表明除肿瘤生长外过表达 miRNA 或干扰 CHD7 可能会消除放疗引起的肿瘤负荷下降（TUNEL 分析），缩短裸鼠的生存期。换句话说，体内 miRNA 介导的 PMT 和放射抗性通过靶向 CHD7 实现。
8、 M2DEs 通过 CHD7/RelB/P50 和 CHD7/p-STAT3 两途径诱导 PMT。
之前 GSEA 证明 CHD7 与 TNFα 通路负相关。RelB 促进 GBM 细胞的间质转化，二者能协同促进 YKL40 表达。过表达 miRNA 或干扰 CHD7 促进 RelB 表达，且 P50 明显升高；敲除 miRNA 会削弱 M2DEs 促进这二者的表达作用。为证明 RelB 是 CHD7 和 PMT 的中间产物，对转染 miRNA 细胞和敲除 CHD7 细胞中的 RelB 进行敲除，发现 PMT 恢复，表明 RelB 促进 PMT 且存在另外的通路引起 CHD7 介导 的PMT。检测 STAT3 的磷酸化发现 p-STAT3 通过过表达 miRNA 或抑制 CHD7 上调，敲除 STAT3 消除 PMT 作用，且干扰 RelB 和 STAT3 彻底使 PMT 消失。综上所述，M2DEs-miRs 通过靶向 CHD7，进而通过 RelB-P50 和 STAT3 磷酸化促进 PMT。
实验思路
生信分析内容总结：
（1）外泌体 miRNA 标准分析内容（参考基因组比对/定量/靶基因预测/差异/功能富集）
（2）高级分析点：GSEA 分析
（3）数据库分析：TCGA 数据库以及 GBM-BioDP 数据库
涉及验证手段：
功能性得失试验；小鼠模型；细胞实验；qPCR；荧光素酶报告基因检测等。
另外，诺禾致源关于外泌体 RNA 系列产品后续将会提供外泌体公共数据库的注释分析服务，包括：
以及全转录组关联分析（调控网络）、蛋白组学关联分析（RNA-蛋白互作网络）以及代谢组学关联分析……..具体详情请咨询当地销售或技术，也可以在评论区进行留言，小编会努力回复哟！
参考文献：
Zhang, Z., Xu, J., Chen, Z., Wang, H., Xue, H., Yang, C., … Li, G. (2020). Transfer of microRNA via Macrophage-Derived Extracellular Vesicles Promotes Proneural-to-Mesenchymal Transition in Glioma Stem Cells. Cancer Immunology Research, canimm.0759.2019. doi:10.1158/2326-6066.cir-19-0759
RNA研究部 于怡琳 | 文案
单晴晴丨编辑
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