全面解读（二）｜你需要了解的 BSA 性状定位都在这里

在遗传学研究中，大量的科研工作利用分子标记确定控制性状的座位信息或数量性状位点（Quantitative trait loci, QTLs），在探索植物或作物复杂性状（如产量）的遗传基础中，BSA（Bulked Sergeant Analysis）与遗传图谱在性状定位方面一直发挥着重要作用。对于家系群体单个性状的主效定位，则采用“小产品”——BSA 性状定位来进行分析，其优势在于群体要求和实验成本较低，对质量性状或者数量性状都可以进行主效基因定位。

虽然 BSA 性状定位的方法相对简单易懂，但是初次接触的老师对于 BSA 项目的很多方面仍存在不少疑问，这一期小诺总结了 BSA 项目常见问题以及拿到候选基因之后如何进行后续实验。

答疑解惑
Q1：什么样的亲本符合 BSA 的要求？尽可能选择性状差异单一，杂合位点少的亲本，亲本间差异不宜过大，避免由于亲本差异导致的假阳性。Q2：如何构建混池？通过表型调查，筛选具有极端表型的个体构建两个混池，质量性状比值符合1:2:1，具有主效位点的数量性状符合正态分布最佳。表型统计不准确，或由多个微效基因控制，会影响定位效果。混池个体性状不极端，存在较多中间型，同样会导致定位结果不佳。Q3：子代混池需要多少样本？质量性状，建议多取样代隐性个体，每个子代池不低于20个，然后取对应数量的显性个体；数量性状，建议每个子代池选择最极端的5%-10%性状的个体，子代池样本数量越多，定位效果越佳。Q4：子代样本如何混池？建议每个子代样本单独提取 DNA 后再等量混合，可以减少背景噪音，避免系统误差。Q5：亲本和子代的测序深度是多少？亲本建议不低于20×，子代混池建议每个样本深度不低于1×，例如一个子代池样本数量为30个，则每个子代混池的测序深度不低于30×。Q6：能否保证定位到的候选区域的大小和候选基因的个数?候选区域的大小和候选基因个数的多少，与群体的大小、亲本材料差异的大小、目标性状特点、测序深度的多少、分析物种的基因组水平等多项因素相关，可以参考项目经验或者已发表文献进行估计。Q7：定位区间偏大，如何调整？可以调整置信区间或者在 BSA 定位区间挑选 SNP、InDel 标记，进行局部作图，有效的缩小定位区间。后续验证


方法一：遗传图谱通过构建遗传图谱并且结合表型数据，进行 QTL 定位分析，获得目的性状关联的候选区间，结合 BSA 分析得到的候选区间，进一步缩小区间范围。方法二：分子标记可以开发分子标记，通过验证群体性状与分子标记的一致性进一步缩小候选区间。方法三：表达谱分析可以通过转录组测序获得相关基因的表达水平，对表达水平具有显著差异的基因进行分析，可缩小 BSA 获得的候选基因范围。方法四：基因功能验证实验可以利用 CRISPR、基因敲除、RNAi、过表达等方法对候选基因进行处理，实现功能缺失型实验验证。方法五：荧光定量PCR可以利用实时荧光定量 PCR 验证候选基因的表达水平变化。案例分享

转座子诱导的 RsMYB1 启动子甲基化干扰红肉萝卜花青素积累

Transposon-induced methylation of the RsMYB1 promoter disturbs the anthocyanin accumulation in red-fleshed radish (Raphanus sativus L.)

期刊：Journal of Experimental Botany

时间：2020年1月

材料选择：MTH01（红肉）和JC01（白肉）F₂群体646个子代

测序策略：子代的平均2×

主要实验方法：BSA 性状定位（QTL-seq），转录组测序，qRT–PCR，全基因组甲基化，病毒诱导基因沉默，过表达。

主要内容：

结合性状定位、基因组重测序和转录组分析，鉴定了一个红肉萝卜花青素积累的候选基因 RsMYB1。而红肉系(MTH01)和白肉系(JC01)的RsMYB1基因编码区和调控区均未发现序列变异，且在 RsMYB1 启动子区均出现了7372 bp的 CACTA 转座子。随后的分析表明，白色肉质突变体是 RsMYB1 启动子 DNA 甲基化改变的结果。这种可遗传的表观遗传变化是由于高甲基化的 CACTA 转座子，它诱导 DNA 甲基化扩散到 RsMYB1 的启动子区域。结果表明，RsMYB1 在白肉突变体中的表达显著下调，抑制了花青素的生物合成。转基因萝卜愈伤组织的检测和病毒诱导的基因沉默实验结果证实，RsMYB1 与花青素积累有关。此外，用去甲基化剂处理部分消除了突变表型。该研究解释了调控红肉萝卜白肉突变体出现的分子机制。

图 基于 QTL-seq 和 RNAseq 分析鉴定 RsMYB1 作为红肉萝卜花青素积累的候选基因作者通过组学，表观修饰以及功能验证，多方面阐释萝卜白肉突变体出现的分子机制。DNA 变异作为物种遗传多样性的基础，不同物种的表型分子机制也可能受到不同类型变异的调控，下一期我们就来讲一讲结构变异对表型性状有哪些影响。关注【诺禾科服】，下期不见不散～

参考文献

Wang Q , Wang Y , Sun H , et al. Transposon-induced methylation of the RsMYB1 promoter disturbs the anthocyanin accumulation in red-fleshed radish (Raphanus sativus L.)[J]. Journal of Experimental Botany, 2020, 71(9).

重测序研究部    王 静 | 文案图片来源于网络，侵删

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