Nanopore+Pacbio=参考基因组完成图

构建参考基因组图谱需要制定测序策略，测序策略发生过多次改变，从 sanger 测序进入 Illumina 测序为主，再过渡至 PacBio/Nanopore 测序为主，但这些都还不能解锁全部图谱，依然有一些区域是“盲区”，参考基因组序列上依然有 gap，因此研究者开始尝试将 Nanopore 和 PacBio 结合在一起。T2T 联盟（Telomere-to-Telomere Consortium）在这个方向走在前沿，近期发表在Nature上的文章“The structure, function and evolution of a complete human chromosome 8” ，再一次告诉我们 —— Nanopore+PacBio=参考基因组完成图。

8号染色体构建过程

测序数据：ONT Ultra-long（20×）和PacBio HiFi （32.4×）。 

图1 Ultra-long ONT and PacBio HiFi 数据质量

分析思路：contigs 构建以 PacBio HiFi 为主，使用到的软件为 HiCanu 、hifiasm ；scaffold 构建以 ONT ultra-long reads 为主；采用 SUNKs（singly unique nucleotide k-mers）文库方法对 PacBio HiFi 和 ONT 数据进行前期标记，将人类8号染色体上的 gap 区域作为组装的目标区域。通过 SUNKs 对ONT ultra-long reads 进行标记，对具有相似标记的 ONT ultra-long reads 进行组装，获得跨越8号染色体 gap 区域的 scaffold 组装结果。为了提升组装的碱基准确性，接下来使用相应的 PacBio HiFi contigs 代替原始的 ONT 序列，并将它们整合到已有的人类8号染色体线性组装中，最终得到人类完整的8号染色体序列。

图2 人8号染色体 Telomere-to-telomere 组装流程图

组装结果：总长度为146,259,671个碱基，填补了 GRCh38 参考基因组中缺失的334,256 个碱基，包括2.08-Mb着丝粒α卫星阵列、对疾病风险很重要的β-防御素基因簇中644kb拷贝数多态性和染色体8q21.2上863kb可变数目串联重复序列。同时利用Bionano光学图谱和Strand-seq（single-cell DNA template strand sequencing）技术，BAC序列和 Illumina 测序数据对组装准确性进行评估，结果显示组装的8号染色体准确度高达99.9915%～99.9999%。

X染色体完成图构建思路回顾

研究者测序获得39×ONT ultra-long 数据与70×PacBio数据，利用 Canu 软件进行初步组装，获得基因组大小为2.9Gb,contig N50=70Mb的参考基因组。结合 PacBio HiFi 数据、ONT 数据、ddPCR 技术对X染色进行手工矫正和 gap 填补。通过X染色体特异性 BACs 数据、 Illumina 数据对X染色体组装结果进行评估，其准确度分别为99.991%，99.995%。

写在最后                            

目前 Nanopore、PacBio 测序厂商都在推出新升级新的产品，其中 Nanopore 公司的 ONT ultra long Kit 已有用户反馈 MinION 平台产出达10-20 Gb， N50为 50-100 kb；PromethION 平台产出达50-100 Gb;，N50 为 50-100 kb。PacBio 公司的 SMRTbell Enzyme Clean Up Kit 2.0, Sequel II Primer v5, Polymerase Binding Kit 2.2 等新版本的试剂和软件，测试反馈能够获得更多准确率达到或超过99.9％准确度 (QV30) 的HiFi reads。由此可见未来将会有更多的物种构建自己的参考基因组完成图。

作为全平台（ONT PromethION 48、PacBio Sequel II、Bionano Saphyr 和 Hi-C 等）的测序服务提供者，“基因组完成图构建计划”正在招募合作者，完成图策略推荐：ONT ultra long +PB HiFi+Bionano+Hi-C。如果您想提升自己的参考基因组版本，欢迎联系 [e-mail] 邮箱或驻地销售，其中 ONT、Bionano 测序更有优惠等你来。

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DENOVO研究部    苏亚南  | 文案

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