EuLV基于稳定细胞系的慢病毒生产系统

■ 背景 

慢病毒载体在细胞治疗和基因治疗中有着广泛的应用。目前临床级别的慢病毒载体基本上都是通过瞬时转染293T细胞的方法生产的，但这种生产方法伴随着工艺复杂、产量较低、质量不稳定、工艺难以放大以及综合成本高等难以克服的缺陷。针对慢病毒载体生产的难题，深研生物深度优化了基因编辑、分子开关等分子生物学技术，设计并实现了独有的高通量细胞自动化筛选工作站，并结合了大数据分析、生物信息学等技术，研发出基于稳定细胞系的EuLV慢病毒载体生产系统。

■ EuLV慢病毒载体生产系统

深研生物开发的EuLV系统是一个基于稳定细胞系的慢病毒载体生产系统，使用可诱导稳定生产细胞系，通过高细胞密度悬浮培养，在化学成分限定培养基（CDM）中生产慢病毒载体。深研生物的EuLV慢病毒载体生产系统使用稳定生产细胞系，不再需要进行质粒转染。系统将所需要的VSV-G, gag/pol, rev以及目的基因GOI稳定插入293T细胞基因组中，再通过药物进行诱导表达慢病毒载体。

■ EuLV系统技术路线

第一阶段，将所有慢病毒包装基因（VSV-G, gag/pol, rev）和分子开关稳定插入293T细胞基因组中，构建EuLV包装细胞系，并筛选和测试最优克隆。

第二阶段，将目标基因GOI稳定插入EuLV包装细胞系中，并进行筛选和测试，获得高产且稳定的单克隆生产细胞系。

第三阶段，在化学成分限定培养基（CDM）中，以高细胞密度悬浮培养的方式，大规模培养EuLV生产细胞，添加诱导剂和补料生产慢病毒载体。

■ EuLV系统优势

与传统的瞬时转染的生产方法相比，深研生物的EuLV系统具有多方面优势：

■ EuLV细胞系开发及筛选

深研生物开发的自动化单克隆筛选平台EuBioX，可自动完成细胞培养的常规操作，例如单克隆细胞系筛选、细胞检测、病毒滴度定量、DoE物料准备。平台已经适应了384孔板至6孔板的操作，并包含非染色活细胞分析系统。平台可以记录、跟踪、分析和挑选性能最佳的单克隆细胞系，在单轮实验中，单次筛选和检测的细胞系克隆数目超过10000个。

在包装细胞系的开发过程中，3.5kb的hPGK-Luciferase-EGFP被插入包装细胞系中，通过荧光定量的方法或流式细胞仪检测，在HT1080细胞中进行相应细胞系所生产的慢病毒载体的转导滴度定量。

通过对细胞系构建方法、细胞筛选方法、慢病毒基因组转录盒的设计和病毒生产过程的优化，EuLV系统进行了一系列优化升级。下图显示了4个设计方案在三轮筛选过程中的病毒滴度结果。每个点代表一个单克隆细胞系，X轴是病毒滴度，经过几轮从384孔板到悬浮培养的筛选后，设计方案B、C、D的平均病毒滴度均高于1x10⁸TU/mL，其中设计方案B和D中最佳单克隆细胞系所生产的病毒滴度高于4x10⁸TU(RLU)/ mL。

■ 比活/空壳率指标的筛选

EuLV在筛选生产细胞系的过程中可以优先挑选具有转导滴度高同时物理滴度低特点的单克隆细胞系，这类细胞系生产出的慢病毒载体比活高、空壳率低，例如下图中蓝色圈内的两个单克隆。

■ 非诱导性泄露测试

EuLV系统的生产细胞系在无添加诱导剂下的产毒滴度与背景对照组中空白的293T相同，约为1x10²TU/mL，将样品超速离心浓缩100倍，病毒滴度仍与对照组中空白的293T没有区别。该实验结果表明EuLV系统中的病毒泄露小于10 TU/ mL。

■ 通过EuLV系统生产慢病毒载体的流程

上图显示了通过EuLV系统慢病毒载体的主要生产步骤。第1天，复苏生产细胞系，在摇瓶中培养。在细胞扩增到第7天后，将细胞转移到波浪式生物反应器中，再培养5天，当细胞密度达到每毫升1x10⁷个细胞时，添加诱导剂和补料开始产生慢病毒。在第14天，收获病毒，进行纯化、制剂和分装等后续步骤。

在1升的波浪式生物反应器中培养到第五天后，细胞密度达到1x10⁷个细胞每毫升，添加诱导剂，收获病毒时细胞活率大于85%。培养基原液的病毒产量为5.3x10¹¹TU(RLU)/L，纯化后的病毒产量为1.2 x10¹¹ TU(RLU)/ L。

■ 简化的慢病毒载体生产和质控

使用EuLV系统，节省了所有质粒相关的生产成本，同时，慢病毒载体的生产步骤被大大简化。生产中，因为不使用质粒，不再需要专门用于质粒生产的GMP厂房和设备，同时，减少了此部分相关的人力和运营成本，最终，简化了慢病毒载体的生产流程，缩短了相关质控流程。使用EuLV系统不仅可以提高慢病毒载体的生产效率，而且可以提高慢病毒载体的质量、增强稳定性、减少批间差，并且生产工艺易于放大。

■ EuLV CRO项目服务时间表

深研生物提供EuLV系统的CRO服务，客户只需提供基因序列或者质粒，深研生物将在4个月内交付相应的单克隆细胞系。深研生物还提供其他可选的服务，包括GOI优化、克隆鉴定及稳定性研究、上下游工艺开发等。

公司简介

深研生物科技有限公司致力于细胞治疗和基因治疗领域中的关键技术和工艺的研究与开发。一方面，深研开发了CellSep PRO全封闭自动化细胞处理系统，能完成从PBMC分离、筛选激活、基因转导、浓缩洗涤、制剂分袋等多个细胞制备生产工艺。另一方面，深研创新性开发了基于稳定生产细胞株大规模生产慢病毒载体的EuLV系统及相关放大工艺，解决了慢病毒载体规模化生产上急需解决的技术瓶颈，大大提升了慢病毒载体的生产效率及产品一致性，并大幅降低生产成本。

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