详尽的引物设计心得及具体流程操作（推荐收藏）
点击上面蓝字↑↑↑关注【解螺旋】
——日读一帖，解螺旋大V团队伴你科研路
【科研热点】让你时间比别人花的少、知道的比他早！
【基金专栏】国自然等各项基金独到经验见解
【SCI 专栏】从开始到接收全程tips
【实验技能】这么棒快告诉你老板！
关注我们，为您的科研路提速
本文作者：张慧慧（长沙 湘雅附二）
本文系参加解螺旋段子手招募作品
查看更多段子手招募详情，请回复“悬赏”
1 克隆载体：
表达载体一般需要的是编码序列（起始密码子ATG到终止密码子TAA/TGA/TGA的序列），也就是NCBI的 coding sequence（CDS）。
一般情况是全长序列，直接取ATG开始的20bp为上游引物，TAA/ TGA/ TAG端的20bp的反向互补序列反向引物。根据载体的酶切位点、读码框的要求在引物的5’端碱基即可。
要注意的是：
①选用的酶切位点在编码序列上是否存在，存在就选择其他酶切位点或者选用同尾酶。
②载体的标签实在插入序列的上游还是下游，在上游编码序列的终止密码就要留，在下游编码序列的终止密码就要去掉。
③读码框是否正确，有些酶切位点会破坏插入序列的读码顺序，这个时候在引物上添加碱基使其正常读码即可。
例如构建EGFP-C1-P53质粒。
① P53序列
绿色表示选取的引物位置（EGFP-C1的GFP标签在插入序列的上游，所以终止密码保留。）
引物序列是：上游引物（与绿色标示的序列一致）5'-ATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3'；下游引物（与绿色标示的序列反向互补）5'-TCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3'
②载体多克隆位点（MCS）分析
我选择酶的原则是价格便宜，常用的酶，例如XhoI/BamHI/HindIII等，这样的酶在很多载体中都会有，有时候可以通用。
分析p53的序列中是否有XhoI/BamHI两个酶切位点，结果是没有，那就可以放心的用这两个酶了。于是引物可以变成
上游引物
5’-CTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’（XhoI）
下游引物
5’-GGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’（BamHI）
酶在发挥作用的时候要有个保护碱基，我认为就是给它一个空间让它发挥作用，保护碱基在百度百科可以查到，于是引物就会变成
上游引物
5’-ccgCTCGAGATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’
下游引物
5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’
③读码分析
XhoI的序列CTC GAG与载体的读码框不一致，载体的读码是 TCT CGA GCT，当用XhoI/BamHI双酶切载体时，最后的CT需要插入序列的AT来代替，就会使插入的序列移码，这时候，只要在插入序列ATG的前面加CT即可，所以引物序列就变成
上游引物
5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’
下游引物
5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’
所以当你给公司发引物序列时就是
上游引物
5’-ccgCTCGAG CTATGGAGGAGCCGCAGTCAGA-3’
下游引物
5’-cgGGATCCTCAGTCTGAGTCAGGCCCTT-3’
因为是全长序列，就表示引物已经定了，没有选择。截短体也是一样的，只要确定了那一段，只要把两端的20bp作为引物序列，然后添加酶切位点序列就可以了。
２ qPCR引物
这里给大家推荐几个网站：
①GenScript Real-time PCR (TaqMan) Primer Design：
https://www.genscript.com/ssl-bin/app/primer#
②Pick primers from a DNA sequence
http://biotools.umassmed.edu/bioapps/primer3_www.cgi
QPCR设计的原则是：跨内含子，长度在150bp以内。现在的试剂盒已经可以不考虑跨内含子，用①中的网站只要粘贴CDS的一段序列即可，网页中有跨内含子选项，有些时候跨内含子可能无结果，可以不用选这一项。还是以p53序列为例。颜色不同代表不同的外显子。
序列越长，分析的越慢，所以不需要全部粘贴。
结果如下：
只需要L1/R1即可，你可以在word中查找引物序列。
第②个网站，是当时做基因敲除时候用到的，因为涉及到内含子和外显子都要分析，就会有重复序列的位置，这个网站可以用[…]将不需要设计的序列包含在内，所以比较符合要求，（重复序列查找网址http://www.repeatmasker.org/cgi-bin/WEBRepeatMasker，重复的序列会用NNN标示出来）
P53基因序列的一段，下划线的部分用[….]包括在内
结果如下，除了这些，网页还会给出备选的引物，你可以随意挑选。
有现成的网页可以用，大家大胆的尝试吧，引物设计没有那么神秘。
解螺旋近期新开了科研交流微信群，大家可以选择感兴趣的热点群和各自的同城群进入，一大波的科研同道在等你一起学术交流噢，请点击此文底部“阅读原文”自由选择合适的科研交流群扫码入群。
文献软件Endnote X6破解版；
引物设计软件Primer Premier；
质粒说明书合集
对上述资源包有兴趣的朋友请转发此文至朋友圈后向解螺旋微信助手索取，助手微信号：helixlife0，二维码如下
扫一扫添加（请长按上图，助手二维码不怕痛）喵~
（解螺旋订阅号页面回复索引号相关数字）
SCI作图实例演练（索引号：213）
医疗卫生系统的坑爹自黑式宣传（索引号：232）
2015年NSFC指南核心内容解读（索引号：244）
你的细胞太丑了，快救救它吧！（索引号：257）
OMG！NCBI竟然能批量下载基因序列!（索引号：264）
杂志界的快枪手！投稿3天居然就接收了！！（索引号：272）
医学SCI投稿必须注意的“礼仪”你都知道了吗？收藏备查噢！（索引号：276）
lncRNA 的研究策略和技术方法（索引号：282）
7分的Cell Reports文章深度剖析！（索引号：273）
基金摘要的凝、集、推、解四段心法（索引号：284）
【怎么查索引号对应的文章？】：
如需查看以上文章，请点击页面右上方
输入相关索引号就可以查看对应的文章啦！查看全部索引号对应文章，那就在该处输入“目录”！