如何用Primer-Blast设计和验证引物
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今天老谈给大家推荐NCBI的一款在线工具Primer-BLAST，用于PCR的特异性引物设计和特异性检验。
推荐的指数：5颗星。
理由：操作简单，使用方便，不需要安装程序，而且和NCBI数据库已比对，不用担心特异性问题。
一、Primer-BLAST介绍
Primer-BLAST可以直接从Blast主页（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）找到，或是直接用下面的链接进入：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/， 这个工具整合了目前流行的Primer3软件，再加上NCBI的Blast进行引物特异性的验证。Primer-BLAST免除了用另一个站点或工具设计引物的步骤，设计好的引物程序直接用Blast进行引物特异性验证。更强大的是Primer-BLAST能设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的引物。Primer-BLAST有许多改进的功能，比单个的用Primer3和NCBI BLAST更加准确。
二、Primer-BLAST的输入
Primer-BLAST界面包括了Primer3和BLAST的功能。提交的界面主要包括4部分：PCR Template（模板区）, Primer Parameters（引物区）, Exon/intron selection（外显子内含子设置）和specificity check（特异性验证区）。
（1）模板（Template）
在“PCR Template”下面的文本框，输入目标模板的序列，FASTA格式或直接用Accession Number。如果你在这里输入了序列，是用于引物的设计。Primer-BLAST就会根据你输入的序列设计特异性引物，并且在目标数据库（在specificity check区选择）是唯一的。
（2）引物（Primers）
如果你已经设计好了引物，要拿来验证引物的好坏。可以在Primer Parameters区填入你的一条或一对引物。并且选择好验证的目标数据库（在specificity check区选择）。根据需要可设置产物的大小，Tm值等。
（3）外显子内含子（Exon/intron）
如果你想设计的引物是跨内含子和外显子的交接处，在这里可以设置成primer must span an exon-exon junction。外显子的匹配碱基数和内含子的长度等设置一般选择默认。
（4）特异性（Specificity）
在specificity check区，选择设计引物或验证引物时的目标数据库和物种。这一步是比较重要的。这里提供了7种数据库：
RefSeq mRNA， Genome (reference assemblies from selected organisms)，RefSeq representative genomes， RefSeq RNA(refseq_rna)，nr (the standard non-redundant database)，Genome (chromosomes from all organisms)和custom。前两个数据库是经过专家注释的数据，这样可以给出更准确的结果。特别是，当你用NCBI的参考序列作为模板和参考序列数据库作为标准来设计引物时，Primer-BLAST可以设计出只扩增某一特定剪接变异体基因的特异引物。
最后建议用oligo6或primer5验证引物自身的特性：发夹结构、引物自身二聚体、错配和引物间二聚体，△G的绝对值。
三、具体操作演示分析
Gene：PTEN, phosphatase and tensin homolog (Homo sapiens)
Accession number：NM_000314
步骤1：按下面截图输入NM_000314.4和设置PCR产物大小70-300，其他默认：
步骤2：点击Get Primers，跳出以下界面（界面运行中）：
等待一段时间后会出现以下界面，有多条引物显示出来，一般选择primer pair 1：
Tips：
1．在任何时候都要优先使用参考序列的Gi号或Accession 号（尽量不要Fasta格式的序列）。另外，确保你的序列是最新版本的（在填Accession Number时后面不加版本号就会自动拿最新的序列）
2．就算你对整个序列的某部分感兴趣（如某条染色体上的某个区域），你也应该优化使用Gi号或Accession 号。因为用Gi号或Accession 号，NCBI会自动读取该序列的一些注释数据，对引物的设计更加有利。
3．尽量使用没有冗除的数据库（eg: refseq_rna 或 genome database），nr数据库包括了太多的冗除的序列，会干扰引物的设计。
4．请指定一个或几个PCR扩增的目标物种。如果不指定在所有的物种搜索，将会使程序变得很慢，引物的结果也会受其它不相关的物种影响。
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