如何用免疫荧光的方法征服萌妹子
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作者：罗雨豪 张菲菲
单位：广州南方医科大学南方医院肿瘤科；
广州南方医科大学基础医学院病理学系
导读：眼见实验室刚来的师妹们都拜倒在大师兄的威信之下，每天跟着后面屁颠屁颠的学实验，一边学还一边投去羡慕崇敬的目光：“师兄，你好厉害，PCR条带好亮”“师兄棒棒哒，western blot杂出来了，而且还好干净”······这样下去怎么得了！看来我得拿出杀手锏，组会上秀秀免疫荧光的高大上照片来巩固一下自己的地位，哈哈。怎么让大家像我一样立马在实验室狂拽炫呢？我们今天就来跟大家分享一下免疫荧光相关的实验经验！
简介：免疫荧光（immunofluorescence）技术是在免疫学，生物化学和显微技术的基础上建立的一项技术，再用荧光抗体（或者）抗原作为探针检测细胞或组织内相应的抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光在细胞或者组织的表达，从而确认抗原或抗体的性质和定位。常用的方法有直接法和间接法。
鉴于目前间接法的应用比较多，今天就给大家谈谈怎么用间接法做出让人心动的图，不多说了，直接上硬菜。
操作步骤：
1、调养好细胞状态，于前一晚种植与六孔板，若是用于转染质粒，推荐种植密度为90%~95%，若是干扰片段或者microRNA的mimics等推荐种植30%~50%密度
2、铺板后24小时内转染，超过24小时转染效率欠佳，90%~95%密度一般Lip2000加10ul/孔，而30%~50%加5ul/孔，目的基因或片段根据样品说明书决定
3、转染24小时后将细胞用胰酶消化，种植于激光共聚焦小皿，若需要拍包膜表达的蛋白，密度可稍微高一点（60%~75%），若普通胞浆或胞核蛋白则密度低一点（20%~40%），很多同学担心铺皿后会被碰翻，有个小技巧可以推荐给大家，将皿置于洁净的六孔板中，对，你没听错，就是常用于细胞转染的六孔板，一方面可以起稳固作用，另一方面六孔板密封性良好，减少污染的可能
4、铺皿24小时后，吸去培养基，过滤级PBS清洗2遍
5、4%的多聚甲醛固定15min，每个皿200ul~300ul
6、过滤级PBS清洗3次，每次5min，可上摇床
7、0.5%Triton破膜穿孔，一般胞浆蛋白或胞膜蛋白10min，胞核蛋白13~15min
8、过滤级PBS清洗3次，每次5min，可上摇床
9、吸净PBS，山羊血清或0.5%BSA封闭30min，个人偏好于用山羊血清封闭
10、吸净山羊血清，一抗（5%BSA稀释）4度孵育过夜
11、室温静置孵育30min，吸去一抗，过滤级PBS洗3次，可上摇床
12、吸去PBS，二抗（5%BSA稀释）室温杂交1小时，从此步起后面所有操作需避光
13、吸去二抗，过滤级PBS清洗3次，可上摇床
14、吸去PBS，DAPI（甲醇稀释）染色5min
15、吸去DAPI，过滤级PBS清洗3次，可上摇床
16、上机检测
如何做免疫荧光共定位
有同学想同时检测两个蛋白在细胞里的表达，看是否存在共定位现象，以此判断是否有可能存在相互作用。共定位操作基本与以上步骤一致，需要改变的是如下几步：步骤10中，需同时加入两种蛋白的一抗，而且必须是不同种属的抗体，比如我抗体A为鼠抗，那么抗体B就不能是鼠抗，常用的是兔抗。步骤12中，需同时加入两种特异性二抗，而且标记的荧光不能一样，比如加入山羊抗鼠的红光和山羊抗兔的绿光，这样若存在共定位，Merge后会出现黄光。
常见问题：
1、为什么我的镜下观察只有DAPI的蓝光，目的荧光几乎没有或者很弱？如图：
答：出现这种现象很有可能是抗体比例太低，需提高抗体浓度，可配合提高二抗浓度；共聚焦的激发荧光强度不够大；二抗孵育时是否是对应的种属，比如本来需要山羊抗鼠结果加为山羊抗兔
2、为什么我的细胞核周围总是存在有一些蓝色的小点点？比如：
答：此种情况一般是支原体污染所致，建议用杀支原体药2周后再检测，或者通过提高共聚焦机器背景值来覆盖支原体荧光
3、共定位的视野该如何选择？
答：共定位时，首先判断哪些细胞是转染成功的，比如我过表达了蛋白A，想做蛋白A和蛋白B的共定位关系，则在视野中寻找已成功转染蛋白A的细胞，一般荧光强度会显著高于周边其他细胞，再在这个细胞上观察蛋白B的表达，如图：
4、视野中细胞与细胞之间存在散在的发光点，如图：
答：有两种情况可造成：1，拍照时PBS量过少引起的非特异性；2，PBS未过滤，未溶解的残渣黏附而导致
优秀作品展：
心得体会：骚年们，心动不如行动。学好免疫荧光是高大上实验必备技能，当你的美图呈然纸上，就是萌妹子在你耳边高声的唱：“就这样被你征服。。。”的时候！
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