Western Blot 之组织蛋白裂解及测定操作步骤
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作者：螺丝钉Fiona
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大家在做动物实验的时候经常会需要利用大鼠组织进行Western Blot检测目的蛋白或者相关蛋白表达量差异情况，今天我就以脑组织为例说说这组织蛋白裂解及测定的具体操作步骤，都是师兄师姐的吐血总结，大家可以参考一下！
一、取材：
1、所用物品：剪刀、骨钳、弯镊、托盘、滤纸、冻存管、液氮罐、-80℃冰箱、冰盒、marker笔
2、所需试剂：10%水合氯醛
3、步骤：
① 10%水合氯醛腹腔麻醉致死，断头取脑，将大鼠脑子剥离后放入托盘内（托盘内铺上一张滤纸），然后将大鼠脑子表面的血管丝剥离干净。
②取目标脑组织分装在冻存管中。[注]第①、②步必须在冰盒内操作，防止蛋白降解。
③ 将冻存管用marker笔编好号后迅速冻到液氮中，使其迅速冷冻，然后再冻到-80℃冰箱备用。[注]为了以防温度骤降，冻存管炸开，从液氮中取出标本时，要缓慢拿出，一般1min/cm，在出瓶口时再缓几分钟，拿出后迅速放入装有碎冰的盒内，再放到-80℃冰箱。
二、蛋白测定
1、所用物品：天平、-80℃冰箱、冰盒、镊子、小剪刀、超声波细胞粉碎机、滤纸、天平、5ml离心管、1.5ml离心管、冰盒、小烧杯、加样器、Tip头、离心机、比色杯、分光光度计、水浴锅。
2、所需试剂：组织蛋白裂解液（ddH2O、SDS、EDTA 、Tris碱、Triton×100、Leupeptin、异丙醇、PMSF、浓盐酸、甘油、DTT、吐温20）、ddH2O、BSA、工作液的A液和B液、SDS、EDTA 、Tris碱、Triton×100、Leupeptin、异丙醇、PMSF、浓盐酸、甘油、DTT、吐温20。
3、步骤：
（1）称重：从-80℃冰箱内取出标本，在冰浴内融化，然后称重。先称5ml离心管，然后再将样品从冻存管中取出放入离心管中，称出总重量。算出样品重量（样品重量=[（离心管+样品）－离心管重]），分别标好号后记录在纸上。
（2）蛋白提取：冰浴内进行
① 向标本中加入冰冷的组织蛋白裂解液，按样品重量：组织蛋白裂解液=1：4（g=ml）或按样品重量：组织蛋白裂解液=1：5（如蛋白浓度较高时，可1：5稀释，通常蛋白浓度，按1：4稀释）。
② 将样品用小剪刀剪碎[注：每剪完一个样品，需用ddH2O冲洗一下剪刀并用滤纸吸干净。
③ 用超声波细胞粉碎机匀浆：
插上电源→将测温探头放入盛有冰水混合物的小烧杯内→打开电源按钮→按“Enter”键设置时间，总时间2min，超声开9.9S，间歇30S，温度2~4℃→然后再用ddH2O冲洗探头，用滤纸吸干，将探头插入装有样品的5ml离心管中，（将5ml离心管放入盛有冰水混合物的小烧杯内）→按开始键进行超声破碎。
[注]：
ａ）每超声完一个样品，都需用ddH2O将探头冲洗干净，滤纸吸干后再行下一个样品；
ｂ）为了防止按下开始键后由于惯性匀浆液溅出，可以先按开始键后再将探头缓慢插入离心管中。
④ 将超声完的组织放在冰浴内，静止裂解30min，（刚超声完的样品上边的沫子静止后可以减少同时增加蛋白的溶出）。
⑤ 预冷离心机使其温度达到4℃（要预先打开30min）。
⑥ 将超声静止后的标本用枪将裂解液移至1.5ml的离心管中，然后在天平称重，配平后4℃，13500rpm/min，离心10min。
⑦ 离心完后取上清，入新的1.5ml EP管中。
⑧ 将剩下的沉淀再加入1倍体积的裂解液混匀，4℃，13500r/min，离心10min，取上清入第5步的管内，第5和第6步的上清为脑组织总蛋白提取液。
⑨ 将脑组织总蛋白提取液按BCA-kit说明检测蛋白含量。然后根据蛋白含量分装成一次western blot所需量（µl/每管），备用。
[注] 如当天或一周内要做，可以先变性（加laoding buffer）后，放在4℃保存；如果短期内不做，则要冻在-80℃冰箱。
另：离心后剩下的沉淀也要再加匀浆液，再次匀浆，这样可以节省样品。
（3）蛋白测定（BCA法测蛋白）
① 标准蛋白的配置（工作范围20-2000µg/ml）
稀释液体积（ddH2O）/µl | BSA体积/µl | BSA浓度（µg/ml） | |
A | 0 | 300 | 2000 |
B | 125 | 375 | 1500 |
C | 325 | 325 | 1000 |
D | 175 | 175µl的B液 | 750 |
E | 325 | 325µl的C液 | 500 |
F | 325 | 325µl的E液 | 250 |
G | 325 | 325µl的F液 | 125 |
H | 400 | 100µl的G液 | 25 |
I | 400 | 0 | 0 |
（一般用ddH2O来调0，一般范围做到2000µg/ml）
② 工作液=A液：B液=50：1
工作液总量=（m个样品+n个标准品）* 200µl
工作液：样品=20：1 （一般每个样品工作液需加200µl）
③ 开37℃水浴锅，预温30min。
④ 每管加入工作液200µl，标准品10µl；
取2ul样品，18ulDDH2O，混匀后再从其中取10ul加入到200ul的工作液中。
⑤ 开分光光度计，预温30min。
⑥ 将标准品和样品放在水浴锅中37℃加热30min，冷却至室温后用分光光度计比色。
⑦ 将分光光度计波长选在562nm处进行比色。比色时先比标准品（先调0，从低向高比），注意每比完一个样品后用DDH2O洗净滤纸吸干后，再比下一个。。
⑧ 得出标准曲线以及标准蛋白的吸光度、浓度以及样品的吸光度、蛋白浓度，然后用excel表格处理。
A | B | C | D | E | F |
标准品吸光度 | 标准品浓度（µg/ml） | 样品吸光度 | 样品浓度（µg/ml） | 稀释10倍前样品真正浓度（D*10） | 100µl的样品需加匀浆液量 |
把A、B值输进去后选中A、B组→点统计图表→选xy点图→下一步→下一步→完成→在图中激活各点按右键→添加趋势线→选项→选公式+R值平方→确定→得出公式y=mx+n，R2=→再将C值代入x得出y值即是D值→E值=D值*10→F值=（E/最小蛋白浓度-1）*100µl
G（µl）=样品总体积= F +100µl
H=需加变性液（loadingbuffer）量=G/3
I=取15µl样品，所含的蛋白量=最小蛋白浓度(ug/ml/1000)=[(最小蛋白浓度µg/µl)*100]/[（G+H）*15µl]
一般20µl左右蛋白应在50-60µg。
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