实验技术八卦课堂：RNA抽提的故事（干货）
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作者: 解螺旋·猫大
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各位同学，我们的八卦课堂开课了！
首先，请向下面这位帅帅的Piotr Chomczynski老爷爷和旁边的Nicoletta Sacchi老奶奶致敬！！！
在很久很久以前，年轻的Piotr Chomczynski老爷爷和Nicoletta Sacchi老奶奶在美国NIH大院里相遇，互相感慨科研经费不好拿啊，仪器设备都贵啊，咱得省着点花钱啊，于是两人一合计，发明了简单便宜的TRizol抽提RNA的方法（Single-step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. 1987. Analytical Biochemistry）。正是因为他们的发明让RNA抽提迅速简便，从此开启了RNA研究的热潮。
Nature Protocols曾高度评价这个伟大发明“大大加快了RNA相关研究的进程，并使non-coding RNAs的发现成为可能”。
现在我们所熟知的TRIzol是Life Technologies公司的商品名，而同样的试剂在Piotr Chomczynski老爷爷创办的MRC公司则被命名为RNAzol（据Piotr Chomczynski老爷爷自己透露，他们已经将RNAzol改进，使抽提得到的RNA无基因组DNA残留）。事实上，这种RNA抽提的方法应该叫做“异硫氰酸胍-酚-氯仿抽提法”。
TRIzol作用原理：
在匀质化或溶解样品中，TRIzol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入氯仿离心后，裂解液分离成水相和有机相。RNA存在于水相。水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇沉淀可从中间相得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
需自备的耗材试剂：
RNase free的一次性带盖透明聚丙烯管（比如AXYGEN的1.5ml EP管，RNase free的，可以拆包即用。话说，我要不要问AXYGEN收广告费啊╮(╯▽╰)╭？）
RNase free的枪头（比如AXYGEN的RNase free的枪头，有盒装的和袋装的，拆包即用）
RNase free玻璃瓶：玻璃瓶200°C烘烤2h即可去除RNase，塑料瓶盖可浸泡10分钟的0.5 M NaOH溶液，然后用RNase free水彻底冲洗，并高压蒸汽灭菌。
氯仿（国产分析纯的即可，比如国药集团产的）
异丙醇（国产分析纯的即可）
RNase free水：即DEPC treated水。把水加入RNase-free玻璃瓶中，加入0.1%（v/v）DEPC用力摇匀，37°C过夜，高温高压灭菌。灭菌时瓶口需拧松，DEPC受高温会分解出大量CO2，注意安全！
75%乙醇（无水乙醇溶于RNase free水中）
简明抽提流程：
裂解
a) 新鲜取材的组织液氮急冻后，每 50-100mg组织加1ml TRIzol，使用强力匀浆机匀浆；
b) 贴壁细胞则弃培养基后每87.5px皿中加入TRIzol试剂1ml吹打裂解；
c) 悬浮细胞则离心沉淀细胞弃培养基，每5-10×106个细胞中加入1ml TRIzol吹打裂解。
Tips：使用TRIzol试剂前避免洗涤组织和细胞，因为这增加了mRNA降解的可能性。
↓
室温孵育5-10min
↓
每1ml TRIzol中加200ul氯仿，用手大力摇管15s，
室温孵育2-3min
↓
2-8°C、12000 g×15min
离心后，混合物分离为下层红色的酚-氯仿相、中间相以及上层无色水相。RNA存在于水相。
↓
转移水相到一个新管，加入500ul异丙醇上下颠倒混匀，室温孵育10min
Tips：转移水相时，枪尖随着液面下移而下移，避免扰乱分层，慢慢吸取，避免吸到中间相和下层有机相，更不要贪心吸太多，吸大约400ul就好。
↓
2-8°C、12000 g×10min
往往离心前RNA不可见，离心后再管侧面和底部形成白色沉淀
↓
弃上清，1ml 75%乙醇洗涤一次，2-8°C、7500 g×5min
Tips：加入75%乙醇时轻轻加进去就好，尽量不要把RNA沉淀吹散，把沉淀保持在原位最好了，因为有时候RNA太少，吹散了再离心下来时RNA碎片不一定能聚集到一起形成肉眼可见的沉淀，导致后面的“盲操作”。而不小心吹散的话也没关系，对RNA质量不会有影响。
↓
尽量吸除上清，室温干燥5-10min，以RNase free水溶解，并保存于-70°C
Tips：密切注意RNA沉淀的干燥程度，不要完全干燥，这将大大降低其溶解度。部分溶解的RNA其A260/280比值会偏低。最佳干燥度为RNA沉淀仍然是白色的，微微湿润呈啫喱状。
OK，搞定！
附言：猫大一直坚信，只要一直奔跑，那一边就是天涯海角！小伙伴们，跟猫大一起加油吧！！！#￣▽￣#)
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