一文包揽细胞转染那些事儿（含操作视频）

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作者：解螺旋·子非鱼

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导语

细胞转染对初接触细胞实验的菜鸟而言，是一道难过的坎儿。当科研汪们在这个坎儿上摔了无数次的跟头后，心里的阴影面积便被无限扩大，似乎只要碰到细胞转染就永无翻身之日。然而现在就放弃该实验还为之过早。正所谓授之以鱼不如授之以渔，同时也为了让大家成功跨过这道坎儿，小鱼这就把做细胞转染的技巧分享给大家，让你分分钟从菜鸟变成细胞转染达人！

细胞转染是指将DNA或RNA导入真核细胞中，用于研究基因功能和蛋白表达分析等，可依据是否整合到细胞基因组，分为瞬时转染（24-96h）和稳定转染。

细胞转染方法类型及不同之处如下面两张图片所示，大家可以依据自己的实验需求来选择不同的实验方法。

其中，实验中应用最广泛的是脂质体介导的细胞转染。

细胞转染具体实验步骤的视频：

https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=x0142ba7h3x&width=500&height=375&auto=0

一般影响转染效率的主要因素：细胞、血清、抗生素、核酸质量与数量、转染技术。只要在这几个因素上多加注意，就可以避免掉进细胞转染效率低下的大坑。

细胞 1. 选择传代次数较低并处于对数生长期的细胞进行转染。对大多数细胞而言，均需要在转染当天或前一天铺板，第二天上午进行转染，48h后收集细胞进行功能检测。对于原代细胞，可用促有丝分裂刺激物进行细胞活化。
2. 对于贴壁细胞，一般要求在转染前一日，用胰酶处理为单细胞悬液，重新接种于培养皿或瓶，最好在转染前4小时换一次新鲜培养液。
3. 支原体污染会严重降低细胞转染的效率，且支原体不会像细菌污染那么明显，因而转染前可用环丙沙星处理细胞以除去支原体。
4. 细胞转染时需要一定的细胞密度，以70-90%（贴壁细胞）或2×10⁶-4×10⁶细胞/ml（悬浮细胞）为宜。 核酸质量和数量 1. 选择高纯度（OD260/280比值在1.8以上）且去除内毒素的DNA进行细胞转染。如果DNA的纯度差，则其携带的少量的盐离子、蛋白、代谢物污染都会显著影响转染复合物的有效形成及转染的效率。又因含有内毒素的质粒会对细胞有很大的毒性作用，因而建议使用QIAGEN公司的超纯质粒抽提试剂盒对DNA进行纯化。
2. DNA分子构象也会影响转染的效率。超螺旋的质粒可达到较高的瞬时转染效率，线性质粒则更容易整合到宿主基因组中。
3. 当转染的DNA会编码对细胞有毒害作用的产物时，可使用弱启动子或可诱导的启动子限制毒性基因产物表达对细胞造成的损害。
4. 对于病毒载体还需考虑安全因素，可设立空载体和用其他基因相同载体构建的阳性对照来排除毒性影响的干扰。
5. DNA含量应该控制在4-6ug，如果超过10ug，转染效率会大大降低。 血清 1. 建议在转染前先测试出对细胞生长良好的血清批号，转染时用同一批号的血清，并设立阴性对照（不加转染试剂及外源DNA）以测试细胞生长是否正常。
2. 为了避免干扰DNA和阳离子脂质体形成复合物，在转染细胞时需用无血清无抗生素的OPTI-MEM培养基来提高转染效率。
3. 转染后4-6小时需更换培养基，一是因为脂质体具有一定毒性，二是因为培养基需要更换成有血清培养基。一般当20%的细胞変圆时，就是加血清的最佳时机。
4. 阳离子脂质体和DNA的最佳量在使用血清时会有所不同，因此如果想在转染培养基中加入血清，需要对条件进行优化。 抗生素 1. 抗生素如青霉素和链霉素，一般对真核细胞无毒，但由于阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，可使抗生素进入细胞，降低了细胞的活性，导致转染效率降低，所以转染培养基中不能使用抗生素。
2. 抗生素在细胞转染后期起到筛选作用，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质，所以筛选不能太早;但是筛选时间也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增殖较慢，时间长了，就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆。一般要在转染48小时之后才开始加抗生素筛选。

3. 挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。在维持抗性筛选过程中，每3~5天都要更换一次含有抗生素的筛选液。

转染试剂

1.许多转染方法需要优化DNA与转染试剂比例，细胞数量，培养及检测时间等。转染时各种培养皿添加质粒和脂质体参考量见下表：

2. 不同质粒和脂质体的最佳搭配比例不同，转染前，需要优化一个最佳配比。质粒：脂质体=1:1,1:1.5,1:2,1:2.5,1:3,1:3.5的梯度比例来检测最佳转染比例（一般质粒带有荧光，可通过观察每组荧光强弱来判断转染效率，没有荧光可通过qPCR来检测各组转染效率）。

3. 用脂质体转染时，要小心轻柔的将脂质体加入到培养基中并轻轻混匀，避免粗暴吹打使脂质体失效。

4在此小鱼向大家推荐两款高性能转染试剂: X-tremeGENE 9和X-tremeGENE HP。它们能够提供高的转染效率、重复性和细胞存活率。

X-tremeGENE 9试剂是一类非脂质体型多组份试剂，具有极低的细胞毒性、操作简便、在含血清条件下对各类常用细胞系仍均具有较高的转染效率等诸多优点，它非常适合开展各类细胞分析应用。

X-tremeGENE HP试剂是一种无动物源成分的非脂质体转染试剂，可成功转染多种真核细胞，包括昆虫细胞和难转染细胞系（如Sf9、U-2 OS、MEF、MCF7、Hep G2、PC-3、HeLa、HT-29、HT-1080、K-562、RAW 264.7、Jurkat、PC-12和HCT 116）。

转染技术 1.设置阴性和阳性对照：一般在转染后24-48h,靶基因即在细胞内表达。可依据不同的实验目的，24-48h后即可进行靶基因表达的检测等实验。
2. 转染后效率的检测方法：观察转染后细胞荧光情况；qPCR验证；WB检测敲减或过表达蛋白。
3. 转染效率低，可采取以下两种方法：1 )复转染，即转染后12-24h再进行转染，前提是该细胞对脂质体的耐受性较好，转染后细胞死亡数较少。2 )通过药筛来杀死未转入成功的细胞，前提是该质粒带有抗生素抗性的基因。

4. 电转时，不同的细胞需要的电压是不一样的，需要做预实验，摸索最佳条件。对于大多数细胞而言，最佳电压位于250-1250v/cm。电击后，应该将DNA和细胞混合液在室温下放置10min,使细胞恢复损伤。

细胞电转的实验步骤的视频：

https://v.qq.com/txp/iframe/player.html?vid=w017082ap33&width=500&height=375&auto=0

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