干货 | 轻松七步掌控免疫荧光
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作者：解螺旋·中子
如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）又称荧光抗体技术，它是标记免疫技术中发展最早的，在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术，对抗原进行细胞定性和定位分析。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。自此该技术在科研领域发光发热啦！
免疫荧光主要有如图两种检测方法：
新手在开始免疫荧光实验的时候，经常被例如细胞铺板密度、细胞固定以及如何确保抗体特异性等问题困扰，以下是中子几年实验下来的一些小小建议，希望可以帮助小伙伴们获得更好的实验结果：
1、 对于细胞爬片的免疫荧光选择合适的细胞种板密度
细胞数过多时，生长过密，细胞结构不清，易导致染色背景深，细胞数过少时，会使贴壁贴壁不佳，状态不好，一般以六孔板为例，（1-5）×100000比较适宜。
2、细胞更好地固定
为达到最佳检测效果，细胞需要经过固定和通透，此步骤很重要，现在固定液选择比较多，有4%多聚甲醛、甲醇、乙醇、丙酮以及丙酮和甲醇混合液（1：1），但效果最好的应用最多的还是推荐4%多聚甲醛。
3、优化封闭液
为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合，需要在一抗孵育前先用血清（与二抗来源一致 如 一抗为兔抗，二抗为山羊抗兔，那么封闭液就用山羊血清）封闭，减弱背景着色。
血清封闭的时间是可以调整的，一般为30min。
4、抗体的特异性，设立对照组
这个关系到结果的准确性，一定要选择特异性强的抗体，这样可以避免高背景和不理想的蛋白定位，并且选择合适的抗体稀释比例，一般1：20-100 之间比较合适，但还是要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱，影响结果的观察噢！加入荧光抗体后一定要记得避光！！！每次试验时 ，建议设置以下三种对照：
① 阳性对照：阳性血清+荧光标记物
② 阴性对照：阴性血清+荧光标记物
③ 荧光标记物对照：PBS+荧光标记物
5、洗涤也要重视
为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色，所以适当地加强清洗（延长时间和增多次数）尤为重要，一般在一抗的清洗是5min*3次；
注意：
（1）单独冲洗，防止交叉反应造成污染。
（2）温柔冲洗，防止切片的脱落；
（3）冲洗的时间要足够，才能彻底洗去结合的物质。
（4）PBS的PH和离子强度的使用和要求，建议PH在7.4-7.6浓度是0.01M。（中性及弱硷性条件（PH7-8）有利于免疫复合物的形成，而酸性条件则有利于分解；低离子强度有利于免疫复合物的形成，而高离子强度则有利于分解）
6、复染和封片是最后收尾工作
复染的目的是形成细胞轮廓，从而更好地对目标蛋白进行定位（一般常用DAPI复染）。而为了长期保存，我们一般用缓冲甘油等封片，此外还有专门的抗荧光萃灭封片液（如博士德等公司）；同时还要注意避免产生气泡。
7、见证“奇迹“的时刻——荧光显微镜下观察实验结果
荧光染色后一般在1h内完成观察，或于4℃保存4h，一般标本在高压灯下照射超过 3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
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