实验新人必读（三）：细胞污染鉴别、处理技能全get
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作者：解螺旋. 刀王
如需转载请注明来源：解螺旋·医生科研助手
作为科研新人，你难免会遇到细胞污染这件事儿？别哭的稀里哗啦！还是擦干眼泪看看前人的总结吧，以免在细胞污染的路上越走越远了。
细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。
细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。
支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。而且它不能用过滤的办法除去。支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。
黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。
真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。
原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。
病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题。
非同种细胞污染 ：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。
洋葱佰克霍尔德菌（Burkholderiacepacia）原属假单胞菌属，是植物病原菌，因引起洋葱患病而得名，是医院感染病原菌之一。
洋葱伯克霍尔德菌是一种广泛存在于土壤及水中，与医院感染密切相关的革兰阴性杆菌，尤其为免疫缺陷及肺囊性纤维化患者易感染细菌之一。它可以在无糖的培养基中生长。在医院环境中常可污染自来水、体温表、喷雾器、静脉导管、导尿管、静脉输液管等，造成院内传播，导致多种医院感染，如败血症、心内膜炎、肺炎、伤口感染、深部脓肿和眼结膜炎等，尤其采用导管植入进行治疗者，更容易引起感染。洋葱伯克霍尔德菌对多种抗菌药具有天然的耐药性。耐药现象严重，治疗可选择复方磺胺甲繟唑、哌拉西林,三唑巴坦、哌拉西林和头孢他啶等抗菌药物。
白色念珠菌污染（倒置）， 白色链球菌是常见的细胞污染
革兰氏染液染色的链球菌
中间长梭型的是正在分裂的念珠菌
真菌感染
支原体污染
霉菌污染
确切的说应该属于丝霉，因为你可以看到明显的菌丝，有些种类是无横隔的，有的是具横隔的，培养基呈淡紫色，或不变色，但会变得粘稠。
污染来源，一般是来自实验服，并且具有季节性，像现在这种长蘑菇的季节很容易污染这种菌类。
细菌污染
你在倒置显微镜下无法看到细菌的结构（需油镜），污染晚期培养基呈黄色。
螨虫污染
这个是原代培养皮肤成纤维细胞时污染的，形态呈杆状，能自主直线游动，速度相当快。。污染源：小鼠毛发中。。。
酵母污染
镜下能隐约看到出芽生殖，不过不知道酵母会不会呈团聚集在一起，因为照片中那团黄色的东西也是此污染物，肉眼观察使可看到明显的白色或淡黄色颗粒状的漂浮物，同样这个污染源也是小鼠的皮肤
培养细胞一经污染，多数较难处理。如果污染细胞价值不大，宜弃之;在寻找原因后彻底消毒操作室，复苏或重新购置细胞，再培养。
若污染细胞价值较大，又难于重新得到，可采取以下办法清除。
一、细菌和真菌的清除
使用抗生素
抗生素对杀灭细菌较有效。联合用药比单独用药效果好。预防用药比污染后再用药效果好。预防用药一般用双抗生素，污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍的冲洗法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此法在污染早期有效。
二、支原体的清除
1、用MRA处理
用MRA(Mycoplasma Removal Agent)处理细胞，每4天换一次液,连续处理15天以确保细胞纯洁健康，效果好。
2、用清洗纯化法清除支原体污染的方法
细胞营养驯化→优质细胞群的筛选→细胞清洗→反复离心洗涤
其原理是利用离心力、细胞、微生物质量和悬液的浮力差达到清除支原体的目的。由于支原体个体小且除发酵支原体外多为细胞外寄生,所以通过反复洗涤细胞和低速离心换液使其中潜在的支原体数量降低至极限。
如结合敏感抗生素的抑杀作用，可达到更好的效果。
3、药物辅助加温处理
先用药物处理后，再将污染的组织培养物放在41℃培养18小时，可杀死支原体，但对细胞有不良影响。
4、使用支原体特异性血清
用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。但此法比较麻烦，不如用抗生素方便、经济。
预防是防止细胞培养过程中发生污染的最好办法。只有预防工作做在前，才能将发生污染的可能性降到最小程度。
一般预防可从以下几方面着手：
1、添加抗生素
2、从物品、用品消毒灭菌着手
细胞培养所用物品清洗、消毒要彻底，各种溶液灭菌除菌要仔细，并在无菌试验阴性后才能使用。
操作室及剩余的无菌器材要定期清洁消毒灭菌。
3、从操作者做起
(1)进无菌室前要用肥皂洗手，按规定穿隔离衣。工作开始要先用75%酒精棉球擦手、擦瓶口和烧灼瓶口。
(2)操作者动作要轻，必须在火焰周围无菌区内打开瓶口，并将瓶口转动烧灼。操作时尽量不要谈话，若打喷嚏或咳嗽应转向背面。
(3)操作时要常更换吸管，一旦发现吸管口接触了手和其他污染物品应弃去。实验完毕用消毒水浸泡的纱布擦台面。
4、防止细胞交叉污染
在进行多种细胞培养操作时，所用器具要严格区分。
在进行换液或传代操作时，注射器和滴管不要触及细胞培养瓶瓶口，以免把细胞带到培养液中污染其他细胞。
细胞一旦购置或从别处引入，均应及早留种冻存，一旦发生污染可重新复苏培养。
5、无菌室的彻底消毒
1) 0.1%新洁尔灭全面彻底擦洗无菌室;
2)甲醛熏蒸法：甲醛是一种广谱灭菌剂菌，其水溶液和气休对各种细菌、芽孢及真菌等微生物均有杀灭作用。
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