一文读懂 | 免疫组化步骤、结果分析及注意事项...
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作者：解螺旋科研大V团队
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实验室花花师姐正在教导新来的师弟：“想拿高分文章，不学免疫组化怎么行？”免疫组化王子毛博旁边插话：“是这个理，今天我就豁出去，将我十多年的心得和经验奉献给小师弟你了。”小师弟感激涕零，唯诺细听两位前辈的教诲......
免疫组化，免疫组织化学技术（immunohistochemistry），是一项利用抗原抗体反应，通过使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对蛋白定位，定性的实验技术。
免疫组化主要用的是组织标本和细胞标本两大类，组织标本包括石蜡切片（病理切片和组织芯片）和冰冻切片。石蜡切片，对组织形态保存好，保存时间也长，虽然对组织抗原暴露有影响，但可以抗原修复，所以石蜡切片仍然是首选的标本制作方法。
结果分析主要有两种方法，阳性着色细胞计数法和评分法。前者是在40*光镜下，随机10个视野下计数阳性着色细胞；后者则是在光学显微镜下按染色程度（0分阴性着色，1分淡黄色，2分浅褐色，3分深褐色）和阳性范围（1分0-25%，2分26-50%，3分51-75%，4分76-100%）评分，最终分数相加。
免疫组化结果分析是毛博的特长，以下是他传授的独门绝技。
1.对照染色
和做实验的时候必须设立对照组一样，免疫组化也必须设立对照染色。没有对照染色的免疫组化结果是不可信的。对照一般有阳性组织对照，阴性组织对照，阴性试剂对照，自身对照。一般来说，有一个阳性组织对照和一个阴性组织对照就足够了。
2.定位
抗原表达必须在特定部位。如LCA应定位在细胞膜上；CK应定位在细胞浆内；PCNA及p53蛋白应定位在细胞核内等等。不在抗原所在部位的阳性着色，不能视为确切的阳性结果。有可能是非特异性染色或者假阳性。不能确定怎么办？这就要用到上一段提到的对照染色了。
3.半定位
现在一般用图像分析系统进行定量。如果你的实验室不幸没有那么高大上的话，就只好赶鸭子上架，用肉眼定一下量了。因为人为主观性比较强，所以只能称作半定量。免疫组化的半定量一般就分为三级：弱（+），中（++），强（+++）。以绿色免疫荧光为例，则表现为浅绿色荧光、明显绿色荧光和亮绿色耀眼荧光。弱（+）=1，中（++）=2，强（+++）=3。至少随机观察5-10个HPF。然后根据（+）% x 1 +（++）% x 2 +（+++）% x 3计算出数值；总数值<1.0者为（+），1.0-1.5者为(++), >1.5者为(+++)。
4.图像分析仪
如果要进行精确定量的话，就要用到图像分析仪。图像分析仪类型很多。这里就不一一介绍了。其实毛博最想隆重推荐的是一款图像分析软件：Image J。毛博当年在米国做博士猴的时候，就是用的这款软件。这是NIH开发的免费软件。一般的免疫组化结果分析用它就绰绰有余了。现在已经开发到了1.50版。网上可以免费下载。其界面非常简洁，如下图所示。
现在，根据一个实例来看看如何用Image J来进行图像分析。如下图所示，我们有一张细胞的免疫荧光染色的照片。那么，如何用Image J来计数细胞的个数呢？
首先，要把彩色的图像转换成黑白图像。步骤如下：Image→Type→16-bit。转换成黑白图像后，将要计数的部分用高亮标示出来。步骤如下：Image→Adjust→Threshold。然后拖动鼠标，直到所有的细胞被标示出来。
有时候2个细胞靠得比较紧密，会被计数为1个细胞。这个时候可以采用Image J的水洗功能。步骤如下：Image→Binary→Watershed。如下图的蓝色箭头所示，这些是本来计数成一个的细胞，经过水洗之后，更加精确地被计数成了2个细胞。
然后，就可以正式开始分析了。步骤如下：Analyze→Analyze Particles。在得出最后的结果之前，还有一些选项需要选择。如果想要计数全部的细胞，那么Size项里面选择“0-infinity”。Circularity的默认值为“0.00-1.00”。一般就取默认值。
最后的结果如下图所示。软件自动测量了每个细胞的大小。这里因为是二维图像，所以就是每个细胞的面积。然后计数了一共有72个细胞，总面积为21286.00，平均大小为295.64。
免疫组化是个苦活，时间长，步骤多，还要经常接触有毒致癌物质。大家辛辛苦苦染出了漂亮的片子，最后都希望得出自己想要的结果。以上，毛博介绍了一些自己的心得体会。希望广大的实验狗们都能做出自己想要的结果，早点发文章。
然而，结果却未必都是那么如意的，常常出现下面这种状况，好好的一张片子染得脏脏的，这就是最常见的非特异性染色。
1. 抗体问题，真的是一分钱一分货啊！
一抗用多克隆抗体容易出现非特异性染色，建议用高纯度，高效价的针对更具特异性抗原决定簇的单克隆抗体来解决。单克隆抗体很贵，不过结果真的很好。尤其是背景非特异性染色不会太深。真是一分价钱一分货。一抗过期也会造成杯具，所以要注意抗体的有效期。
2. 抗体浓度过高/孵育时间过长
一抗浓度太高也是出现非特异性染色的常见原因。解决的办法就是预实验。每次使用新抗体前应该多做预实验，摸索出最理想的工作浓度，不能简单地按照说明书来用。另一个常见原因就是孵育时间过长。解决的办法就是定时器。加上抗体后，立刻调好定时器，提醒自己及时终止反应，就会避免这个问题。
3. DAB染色时间太长/变质
DAB的孵育时间过长，会造成背景非特异性染色。DAB的显色时间不是一成不变的，主要靠自己在显微镜下盯着，一旦出现浅浅的棕色的时候，就要马上冲洗。出现棕色的时间过短，表明抗体浓度过高；出现棕色的时间过长，表明抗体浓度过低。DAB要保存于避光干燥的地方，现用现配，临用前才加入H2O2。图1就冲洗的有些晚了；图2就是刚刚好，染色效果棒棒哒!
4. 内源性酶和生物素
内源性酶和生物素也会造成非特异性染色，特别是一些内源性酶生物素含量丰富的组织，如肝脏，肾脏，脾脏等。处理的办法为：灭活碱性磷酸酶：最常用的方法是将左旋咪唑（24 mg/mL）加入底物液中，并保持PH值在7.6-8.2，即能除去大部分内源性碱性磷酸酶；对于酸性磷酸酶，可以用50 mmol/L的酒石酸抑制；对于内源性过氧化物酶，可以用0.9%的双氧水来灭活。对于内源性生物素，染色前将切片浸于25 μg/mL亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。也可以24 mg/mL的卵白素封片15分钟。
5. 组织变干
一下子染太多片子的时候，容易出现这种情况。解决的办法就是不要贪多嚼不烂。一次少染几张。还有就是试剂充分覆盖组织，超出组织边缘2 mm。然后用PAP笔在组织周围画一个圈圈，把修复液圈在里面。避免修复液流走。圈圈应该距离组织边缘3-4 mm。
6. 浸泡时间过长
切片在缓冲液或修复液里面浸泡过夜，也会引起杯具。这都是偷懒的做法。但是有时候也是可以偷一下懒的。毛博的独门秘技就是4°C冰箱。只要把容器放在4°C冰箱里，过夜完全没有问题。
7. 清洗不充分
清洗一定要充分。PBS液一定要双蒸水新配，用之前再次测PH值。缓冲液用0.05 mol/L的Tris-HCL，0.15 mol/L的NaCl即可。如果加一点去垢剂Tween-20就更好了。
8. 封闭血清问题
是否选择了正确的封闭血清。原则是选择二抗动物的非免疫血清，例如二抗是羊抗兔，就要选择非免疫羊血清。用PBS稀释为3-10%的溶液孵育切片，37°C 10-30分钟。这里不用洗，直接甩掉即可。毛博再贡献一个独门绝招，直接用奶粉也可以。用5%的脱脂奶粉就可以了。而且效果还不错。怎么样？简单吧。
师傅领进门，造化看个人了。
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