Primer Premier 6安装、破解、引物设计实操攻略

作者：叶子

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Primer Premier是国际知名的引物设计软件，其公司已连续发布了多个版本，到目前为止，最新版本是Primer Premier6。相比于Primer Premier 5，Primer Premier 6在很多方面做了改进与优化，例如引物设计的温度Tm值等。但是相比较于5,6并没有出现大量的可供使用者激活的注册机，所以用了一种很奇葩的Java破解法，来一步步看看怎么做吧。（获取方法点这里）

安装破解

首先，说明一点现在最新的Primer Premier小版本已经更新到了6.24，但后面几版把破解漏洞修复了，所以目前只能搞定6.00。下载完资源包后，根据自己的系统，安装相应的JAVA运行环境。

然后，和平时一样安装在PP6文件夹里的PP600Installer，完事后把patcher.jar复制进这个地方：安装位置\http\Dwww.premierbiosoft.com\P80\DMIUpdater\DMPP\DM600。

复制完应该是这样的，如果双击无效的话就右键——打开方式——选JAVA。

如果还是不行就要改注册表了，在开始菜单输入“regedit”进入注册表编辑器中，找到“HKEY_CLASSES_ROOT\Applications\javaw.exe\shell\open\command”，修改参数，保存并退出注册表编辑器。

引物设计

安装完之后，就要开始引物设计了，这就需要知道基因序列。一般用NCBI查找，比如要设计rat的CK18 mRNA检测引物。首先选择Nucleotide，然后在搜索栏输入rat CK18，结果如下。

我们要找mRNA，所以选第一个，点进去后拉到最后的ORIGIN就能找到基因序列。

把这段序列复制到Primer Premier6进行引物设计。

点这里的新建按钮会出现对话框，将上面那段序列复制进去，点Add。

然后点这个搜索，出现下面对话框，这里可以选择引物在序列哪些地方设计引物，一般不用更改，也就是引物可以设计在整个序列，当然也可以事先查一下序列有几个区，一般引物会跨两个区。

接下来设置退火温度、引物长度、产物长度等，点旁边的“Primer Parameters”。主要更改的也就是产物长度，100到300bp为宜，产物太大，会影响扩增效率。

点“Search”后，引物序列就出来啦。

验证引物

光设计出引物还不行，还要进行验证，也是在NCBI上进行。在最下方找到“Primer-BLAST”将Primer Premier6设计的引物复制进去。

注意，复制前引物用 Copy Sense Primer ，复制后引物用 Copy Anti-sence Primer ，在引物上点击右键就出来了。在下方“Organism”中选 “Rattus （taxid：10114）” ，最后点 “Get Primers” ，马上验证报告出来了。

这么长的验证报告要怎么看呢？它的结果顺序是将产物由小到大排列的，而太大的产物，比如Ahsg 产物795bp，在PCR反应时是扩增不出来的。也就是说，这个引物在扩增的时候只会出CK18这个我们要的基因，特异性很好。

我们可以拿这个引物去找公司合成。在需要引物时我们也可以到文献中查找，一般发表在全球著名杂志中的外文文献里的引物都是可以用的，不过要注意的是文献中用的是染料法还是探针法，探针法的引物在染料法中效果不佳。

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