疫情封校师妹主动隔离在实验室养细胞，现在细胞没了人还出不来！

解螺旋公众号·陪伴你科研的第2898天

你的细胞还好吗？

有的细胞，养着养着就飘了；有的细胞，养着养着就污了；有的细胞，养着养着就没了 ；有的师妹，看着看着就......

自从实验室新来的师妹养了细胞，她整个人都变得神经兮兮，恨不得时刻都要守着它，同它定期谈心解闷，为它做心理诊疗。疫情期间，她为了每天照顾细胞，甚至主动隔离在实验室。

对于那些柔弱的细胞，她更是花大心思呵护，死死守住「呵护柔弱细胞的各项准则」，并严格执行。例如，胰酶消化不能过久，吹的时候要轻柔，离心的时候要注意转速和时间。每天都要去看亿下细胞，肉眼观察培养基状况，显微镜下观察细胞生长的状况。

一旦发现显微镜下出现类似杂菌和小黑点，整个人就开始狂躁，如果有支原体出现的迹象，她整个人似乎要陷入窒息状态。

就这样坚持了很长一段时间，师妹看着细胞茁壮成长，实验眼看就要出结果了，以为发SCI的胜利时刻就在眼前了，第二天醒来，她却发现细胞都挂了，此时她因为实验室封闭不仅回不了宿舍去调整心情，还无法重新购置一批新的细胞重头来过……

此刻，师妹有多崩溃，细胞有多矫情，相信大家都感受到了。总之，养细胞就要像养孩子一样，不仅要有温柔和耐心， 还要掌握TA的生长习惯， 注重TA的生长环境，最为重要的是你得有足够的技巧去驾驭TA。

正所谓“万事开头难”，即便是细胞复苏与保存这两件看似简单的事情，也能造成实验汪内心无比巨大的阴影面积。

好在养了6年细胞的我，手里有本细胞培养秘籍，可让细胞这个脆弱的熊孩子彻底变为师妹的实验好帮手，拯救正在被细胞折磨的各位实验室打工人！干货秘籍如下：

细胞复苏步骤：

细胞冻存步骤：

其实，刚刚复苏的细胞就像是刚刚出生的baby，非常脆弱，需要各位小伙伴的细心呵护，不然，细胞就会被我们花样养死。为了避免细胞不明不白的挂掉，我们就要对细胞的各种习性了如指掌。

1.  俗语道，到什么山上唱什么歌，不同细胞用不同的培养液。此时，就不得不提起培养基里的“四大金刚”—MEM、DMEM、1640、F-12，它们基本参与了90%以上种类细胞的培养过程。

MEM作为带头大哥，能力非常全面，号称是应用最广泛的细胞培养液。

DMEM作为随时紧跟老大MEM的二弟，青出于蓝而胜于蓝，浓度要高出2~4倍，可分为高糖型（含葡萄糖4500mg/L）和低糖型（含葡萄糖1000mg/L）。

老三1640中规中矩，营养成分比较简单，比DMEM少一点糖和谷光甘肽，常用于淋巴细胞的培养。

小兄弟F12常用来支持CHO、Hela和L－细胞生长以及原代大鼠肝细胞和前列腺上皮细胞的培养。MEM和F12 这两种培养基各取1/2，即可形成神经生物学最通用的培养基。

在此，奉送一个不同细胞系对应的不同培养液的图，供大家参考。

2.  细胞生长的空间密度是细胞培养的关键。具体养细胞时应该摸索细胞喜欢的生长空间密度，即不能让细胞瓶里的细胞因拥挤不堪而萎靡不振；也不能让细胞浓度低于1~5×10⁵个/mL而导致“孤独死”（因为细胞的健康生长需要细胞间的连接）。因而细胞接种前，要先通过细胞计数来调整细胞浓度。

3.  当培养的贴壁细胞形态不好时，可在传代时，先倒掉旧的培养基，加入3ml新的培养基（有无血清都可以）洗涤一次，用滴管吸走，再加入3ml培养基，沿着瓶底轻轻吹打一遍，然后吸走。这时再正式进行消化、吹打。

其次，把吹打下的细胞悬液加入到含有新培养基的培养瓶内，置于培养箱里培养，按时间点观察细胞贴壁情况（10min,20min,30min）。而后迅速倒出其中的培养基，加入3ml新培养基再轻轻洗一次，然后加入完全培养基培养并观察细胞生长情况以及形态。直至找到细胞完美的形态为止。

4.  至于在培养瓶中加入多少培养基量，则需要实验汪们自己去摸索的。对于生长快的细胞，易生长的细胞加少一点培养基，细胞形态会更好，但是要注意对换液时间的把握。

5.  如何选择培养瓶：一般，生长速度慢的细胞如果想要更漂亮的细胞状态，那么采用塑料瓶会比玻璃瓶的效果好；生长速度快的细胞，用玻璃瓶培养的效果会更好。因此，对于同一种细胞，在其生长速度慢的时候（比如细胞刚复苏时或者原代培养），塑料瓶会好一点；而在其生长旺盛的时候，玻璃瓶则相对会好一点。

6.  细胞冻存时，盖子要拧紧，不然复苏水浴时会渗水，造成细胞污染。因而冻存管要选择原配的管子和盖子（不同牌子、型号的管子会有差别），盖子拧紧后最好用封口膜封住。且每支冻存管都要标上细胞的名称、冻存时间，并记录在册，以免后续复苏细胞时，取错细胞。

7.  细胞冻存时要严格进行梯度降温（-4℃→-20℃~-40℃→-80℃→液氮）。要知道冰火两重天的生活环境只会让娇弱的细胞自爆身亡，谨记：缓降温！但如果真心赶时间时，可使用细胞冻存盒进行细胞冻存，而后尽快将其转入液氮中。此外，要定期测量液氮罐里的液氮储备，以保证细胞全部浸在液面下。

8.  细胞解冻时，由于冻存管管壁较厚、隔热，而导致水浴时间太长（2min还没融化）时，可以将水浴锅的温度调至40℃左右，可以缩短解冻时间。

9.  提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间，可避免细胞房人满为患，超净台使用紧张，复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会对细胞有毒性）

10.  复苏细胞时一定要有耐心，因为有些细胞在复苏一星期后才会真正有起色。因而，尽管细胞在复苏三四天后没有任何动静，也不要轻易倒掉所有细胞，要耐心等待，两周后再做决定。

11.  有关DMSO的一些注意事项：

DMSO能够快速穿透细胞膜进入细胞中，降低冰点、延缓冻存过程，同时提高细胞内的离子浓度、减少细胞内冰晶的形成，从而减少细胞损伤程度。

DMSO在溶解过程中会放热，应先与培养基混匀后再加血清，同时冻存液最好提前配置，DMSO现配对细胞的毒性可能更大；

复苏时，要离心去除DMSO，并用新鲜的培养基洗涤1-2次，注意离心的时候速度不要太快。

细胞培养小技巧今天就讲到这里。建议你可以先把这篇文章保存下来，当你遇到问题的时候再来看也许会更有感觉。

其实很多时候，我们是不清楚到底是哪方面出现问题的，这个时候就需要一步步去排除可能原因，切勿盲目地一次性改变多个条件。

细胞培养是一个不断进步的过程，要想成为达人，看几篇文章哪够？在平时做好积累，量变才会有质变，《细胞培养（第3版）》则全方位介绍了细胞培养的方方面面，实为一本不错实验秘籍，收下即可顺利发SCI！

《细胞培养（第三版）》

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必读理由一：带小白进入细胞界的“领路书"

本书作为研究生教学用书,简要介绍细胞培养的基础理论，较详细地叙述哺乳类动物细胞培养必需的用品器材、具体的操作步骤及操作提示等。手把手教你培养细胞，很适合小白入门。

必读理由二：细胞培养届的“百科全书”

本书除了细胞培养基本知识，细胞培养室的设置、设备和准备工作，细胞培养用液及培养基外，本书还补充了一些细胞培养的新技术，如三维细胞培养技术、各类肿瘤试验模型、诱导多能干细胞培养、细胞克隆形成及杂交瘤细胞制备等。一本书就可以掌握细胞培养术，高效又全面，可为大家节省不少搜集资料和经验的时间和精力。

必读理由三：补充了细胞培养新技术

内含细胞培养新技术：三维细胞培养，诱导多能干细胞培养，肿瘤干细胞培养。

必读理由四：细胞检测相关的仪器分析技术

内含细胞检测相关的仪器分析技术：流式细胞仪、激光扫描共聚焦显微镜、扫描电子电镜、透射电子电镜、原子力显微镜及活细胞工作站。

作为一本养细胞的经典书籍，这本书自诞生以来更是好评不断，我随手给大家放两条读者好评，供大家参考。

总而言之，它绝对是实验室打工人最需要的一本书，虽然网络上细胞培养的相关文章满天飞，但是内容不一定精确、齐全，所以如果你是准备进行细胞培养的人，那我们墙裂建议细胞新手，用这本书系统学习一下。

划动看看目录

目录介绍：

第一章 绪论 
第一节 组织培养的诞生与发展简史 
第二节 组织培养的优点、局限性及发展方向 
一、组织培养的优点 
二、组织培养的局限性 
三、组织培养的可能发展方向 
第三节 组织培养常用术语 
第四节 组织培养常用缩写词 
第二章 细胞培养的基本条件 
第一节 细胞培养实验室的建立 
一、实验室设计原则与要求 
二、实验室的布局 
三、细胞培养实验室的基本设备 
第二节 培养仪器和材料 
一、常用仪器设备 
二、培养器皿与其他材料 
三、培养用品的清洗和消毒 
第三节 培养用液 
一、培养基 
二、其他培养用液 
三、细胞培养所用液体的灭菌与保存 
第三章 细胞培养的基本技术 
第一节 显微镜观察 
一、相差显微镜 
二、微分干涉差显微镜技术 
三、荧光显微镜 
四、激光共聚焦扫描显微镜 
五、电子显微镜 
第二节 流式细胞仪技术 
第四章 体外培养的基本组织 
di一节 上皮组织 
一、内皮细胞的培养 
二、单层柱状上皮细胞的培养 
三、假复层纤毛柱状上皮细胞的培养 
四、复层扁平上皮细胞的培养 
第二节 结缔组织 
一、成纤维细胞的培养 
二、巨噬细胞的培养 
三、脂肪细胞的培养 
四、肥大细胞的培养 
五、血细胞的培养 
六、淋巴细胞的培养 
七、软骨细胞的培养 
八、骨细胞的培养 
第三节 肌组织 
一、心肌细胞的培养 
二、平滑肌细胞的培养 
三、骨骼肌细胞的培养 
第四节 神经组织 
一、神经元的培养 
二、神经胶质细胞的培养 
第五节 细胞运动的观察 
一、噬动轨迹法 
二、细胞刮除法 
三、细胞培养池法 
四、数字影像法 
第六节 细胞培养的生长测定 
一、细胞计数法 
二、台盼蓝染色法 
三、MTT比色法 
四、细胞生长曲线法 
五、—TdR掺入法 
六、BrdU掺入法 
第七节 细胞的冻存、复苏和运输 
一、细胞的冻存 
二、细胞的复苏 
三、细胞的运输 
第五章 细胞系的建立和鉴定 
di一节 正常细胞系的建立和鉴定 
一、正常细胞系建立 
二、正常细胞系建立的例证 
三、建立正常细胞系的讨论和小结 
四、正常细胞系的鉴定 
五、正常细胞系鉴定讨论及小结 
第二节 癌细胞系、转化细胞系的建立和鉴定 
一、癌细胞系的建立 
二、癌细胞建系的例证 
三、转化细胞系建立 
四、癌细胞和转化细胞建系讨论和小结 
五、癌细胞系和转化细胞系的鉴定 
六、癌细胞和转化细胞系建立和鉴定的小结和讨论 
第六章 细胞周期分析与细胞克隆化技术 
di一节 细胞周期概述 
第二节 细胞周期调控 
第三节 细胞同步化方法 
一、使细胞同步化在Go／G1期方法 
二、使细胞同步化在G1期 
三、使细胞同步化在G1／S期交界点 
四、使细胞同步化在有丝分裂期（M期） 
第四节 细胞周期分析 
一、流式细胞仪分析细胞周期 
二、H—TdR掺入DNA法 
三、PA法 
四、测定细胞周期的其他方法 
第五节 细胞克隆的概念及培养方法 
一、细胞克隆的基本概念 
二、细胞克隆的培养方法 
第七章 器官培养 
di一节 器官培养的要求 
一、器官培养的取材 
二、培养基 
三、培养环境中的气体 
四、培养器官的支持物 
第二节 器官培养技术的特点 
一、优点 
二、不足 
第三节 器官培养的方法 
一、固体培养基器官培养法 
二、液体培养基器官培养法 
三、动态器官培养法 
四、体内器官培养法 
第四节 器官培养的应用 
一、器官培养在胚胎发育研究中的应用 
二、器官培养在器官功能及其代谢研究中应用 
三、器官培养在肿瘤侵袭研究中的应用 
第八章 干细胞的培养 
di一节 胚胎干细胞 
一、胚胎干细胞的培养 
二、胚胎干细胞的形态特征及其鉴定 
第二节 神经干细胞 
一、神经干细胞的概念及生物学特征 
二、神经干细胞的分离与培养 
第三节 造血干细胞 
一、造血干细胞的定义及生物学特征 
二、造血干细胞的分离及培养 
第四节 间充质干细胞 
一、从骨髓细胞中分离MSC细胞 
二、流式细胞仪分离鉴定MSC 
三、MSCs克隆形成试验 
四、人的MSC细胞系培养 
五、MSC细胞向脂肪细胞谱系分化 
六、MSC诱导分化为软骨细胞软骨细胞团试验 
七、MSC诱导分化为成骨细胞谱系 
八、不同组织来源的MSC的特殊表面标志 
第五节 表皮组织干细胞 
一、移植人皮肤培养表皮干细胞 
二、角质形成细胞的鉴定 
第六节 胰岛干细胞 
一、人胰腺导管制备胰岛干细胞 
二、从小鼠胚胎干细胞系定向诱导分化为胰岛干细胞 
第七节 鉴定干细胞及分化细胞类型的标志 
第八节 体细胞重编程为多能干细胞 
第九章 细胞培养在细胞分化研究中的应用 
第十章 细胞培养在细胞衰老、凋亡研究中的应用 
第十一章 细胞融合与单克隆抗体制备 
第十二章 细胞培养的应用 
第十三章 细胞毒性 
第十四章 细胞培养常见问题解答 
附录Ⅰ 实验室常用的细胞系（株） 
附录Ⅱ—1 常用缓冲液 
附录Ⅱ—2 其他缓冲液的配制 
附录Ⅲ 常用人工合成细胞培养基 
附录Ⅳ 细胞培养常用英语词汇 
中英文名词对照索引

  适领人群：

生物学、医学等相关专业学生生物、医学科研相关从业人员正在实验室打工或是即将进入实验室的你

最后，祝你的细胞宝宝健康成长，积极献身于伟大的实验事业！大家对细胞培养方面还有什么想要了解的，都可以留言中告诉我哦~我将在线为各位答疑解惑！

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撰文丨解螺旋

排版丨豨莶