技术 | 磷酸化蛋白Western跑不出来好捉急，解螺旋给你支招
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作者：解螺旋.大肚腩
转载请注明来源：解螺旋，医生科研助手
话说我做硕士课题的时候需要跑磷酸化的AMPK（p-AMPK），当时同组四五个孩子一起跑，效果都很不理想，要么是条带过淡，要么是根本出不来。那几个月的时间我们疯狂的到处请教师兄师姐，在各种实验论坛上寻找改进方法，最终出来效果不错，文章也发了，在此总结几个Western跑磷酸化蛋白的要点，希望各位科研民工们少走弯路。
抗体
工欲善其事必先利其器，抗体很关键。这里我们要说的并不是最贵的就是最好的，如果条件允许，建议同时购买不同厂家的抗体，一起来试一试，因为有时候即使是最好的品牌，不同批次稳定性也不一样。抗体从订购到到货有一定的时间，所以到货后请尽快分装好，准备做实验，我们当时因为实验进度问题，抗体到了3个多月才开始正式实验，这样拖了时间找厂家售后申诉也是很被动的。
我们那时候用CST的一抗，感觉效果不稳定，也可能跟抗体放久了有关。最后买了另一家代理的抗体算是有了比较稳定的结果。当然，还是选择购买口碑较好的公司的产品为佳，这样即使出了问题售后也会跟进。如果经费有限，可以买买小包装的产品先试试，不少抗体公司还有5ul的抗体试用装免费申请。
再者，孵育一抗的时候，建议用新鲜抗体，什么意思呢？很多同学因为想图省事儿，很多时候配好孵育液，每次孵育好之后再次放进冰箱等待下次重复利用，一些比较好跑的蛋白到时没啥问题，但是磷酸化的蛋白建议每次都用新鲜的抗体原液，将条带剪下来后用杂交袋塑封好，按1：1000的比例加入抗体原液孵育，再这种情况下，100ul的抗体也是能用很久的，所以尽量每次都用新的抗体。
蛋白上样
普遍反映磷酸化的条带很淡，有时候达不到制图标准，这点可以加大上样量来解决，另外，磷酸化蛋白一般与非磷酸化的蛋白一起跑一起制图，它本来就是要比非磷酸化的要淡一些，不要过分担心。
电泳
不同kb的蛋白电泳时间有所差别，参数啥的要用脑子更改，不能一成不变，避免发生那种蛋白跑不见了的惨剧。
封闭
这个步骤非常重要，强推BSA封闭，不要用脱脂奶粉封闭，BSA封闭对磷酸化的抗体效果非常好，而且也不贵，具体怎么配百度之。另外，BSA封闭液倒是可以反复使用不至于向奶粉一样臭掉，用来孵育一般非磷酸化的抗体，效果同样棒棒哒！
再者，封闭时间可以延长，一般封闭2-3小时的情况下，可以封闭延时到4小时，所以按照从早到晚做实验的时间，用BSA配好封闭液开始封闭的时候，您就可以慢慢的约个火锅唱个歌再回来了，实验本来就很辛苦，不要再依赖百度外卖大叔了。
洗膜
严格遵守洗膜时间，不得减少次数，每个步骤洗3次，每次可以洗长一点，比如（11-12分钟）。
最后向大过年还在跑Western的同学们致敬，条带会有的，文章会有哒！！大家新年快乐啦！
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