技术课堂∣基于LC-MS代谢组学的数据质量控制
PAGE 1
对
于样品比较多的代谢组学研究，基于LC-MS方法的主要挑战就是随着检测时间推移检测系统的变化，因而，基于LC-MS代谢组学分析过程中，实验人员需要检测数据的质量。今天小淼参考一篇Nature Protocol 的经典文章，来和大家聊聊基于LC-MS代谢组学数据采集中数据质量控制的那些标准，同时，这也是博淼生物代谢组学平台保证为客户提供可靠数据的标准。
混合物和质量控制（QC）样品检测
代谢组学分析往往采用样本量较大的样品队列，为了保证LC-MS获得的整体代谢指纹有效性，代谢组学研究者目前提出了多种方法，这些方法包括内标的应用，检测混合物和QC样品的检测。其中非靶向代谢组学中检测混合物和QC样品为分析数据质量的常用方法。对于一个典型的样品队列分析，检测混合物在样品队列的开始和结束进行检测，QC样品按照一定间隔（如每10个样品）插入整个样品测定过程。测定顺序如图1所示。
图1 典型的代谢组学样品队列分析
检测用混合物由商业标准品混合制备，检测已知的混合物为评估仪器检测结果的快速方法（评估内容包括RT稳定性，峰形，检测器的响应，和质量的准确性）。混合物需要在样品队列的开始和最后都进行检测。混合物测定的数据（RT，峰形，信号强度，质量准确性等）可用于快速确定仪器的设置是否适合待测样品（第一次进样）并且能够确定样品测定过程仪器是否有较大的变化（最后进样）。如果检测过程中仪器发生了较大变化，样品测定的数据则会失效。但是，即使混合物检测的数据在可以接受的范围内也不能够确定样品的分析没有问题，因为样品与标准品混合物相比更加复杂，这种复杂性可能会引起变化。样品数据可以通过QC进行进一步评估。
QC样品检测能够提供数据重复性的评价标准。对于一组样本较少的样品而言，QC样品是所有样品的混合物，通过所有待测样品的等量混合来制备，能够代表所有的样品。对于样品多的实验，如流行病学或多大型多医学中心联合临床研究，这样的研究中样品需要检测的样本达到几千个历时很多个月，待测样品中的代表性样品可用来制备批量的QC样品，等分后冷冻保存直到检测避免反复冻融。
QC样品的分析有几个步骤，PCA分析是简单多元数据分析的初步方法。从概念上来讲，如果样品分析做得很好，PCA应该显示第一个平衡系统QC样品对之后系统平衡QC样品的追踪现象。确定系统已经充分稳定后，开始测定的QC样品数据直接去除掉而样品测定序列中的QC需要进行详细审查。图2显示了一个基于LC-MS的非靶向代谢组学项目的PCA得分图，图中最开始的QC样品用红色标识出来。图中可以看到前3个系统平衡阶段的QC样品对系统平衡后QC样品的追踪现象。而系统平衡后QC样本紧密聚集在一起表明，数据值得进一步的分析。值得注意的稳定系统需要的QC样本个数与要测定的样品有关，如尿液样品的检验需要的前期QC样品多。如果运行过程中出现问题，QC的分布面积将分散开，这种情况下数据将不可用。
图2 基于UPLC-MS正离子模式获得的人尿液样品（蓝色）
和QC(红色)的二维主成分得分图
数据评估
◆◆流程1除混合物测定和QC的PCA分析外，可以进行更详细的数据评估（图3），如检测部分QC样品峰的RT稳定性。对于UPLC，RT的差异通常可以忽略，变异系数值（CV）< 1%。这些峰的峰高/面积的相似性检测也应该显示较好的重复性（峰高/面积依赖于离子强度，强离子通常给出更好的重复性）。峰离子的质量准确性差异也要小。由于QC样品为所有样品重复性的证据，检查来自整个QC数据集的变异性，可用于证明整体重复性。
2对于用单离子作为生物标志物而言，变异性该用什么样的标准目前还没有达成一致。但是，对于常规的生物分析，食品和药物管理总局（FDA）建议用数值CV的15%（不包含接近定量限的浓度，这些峰用原数值的20%），对于生物标志物30%的上限是可以接受的。因而，我们建议潜在生物标志物的例子要通过这个方法评估，变化大的离子（CV大于30%）在生物标志物的指认中要去掉。目前基于LC-MS产生数据的一个流程已深入人心，这个流程展示在图4中，图中数据分析为寻找生物标志物的一部分。我们认为，这个流程中哪一阶段不能够通过都需要进行数据的重新分析。
图3 数据有效性验证指南
分析过程中样品的稳定性
对于任何样品比较多的代谢指纹研究，样品测定过程从第一个到最后一个将会达到24h或更长时间，因而意味着样品测定前要在自动进样器放置一段时间（< 4 ℃）。显然，这段时间样品内某些代谢物的降解会对后面数据的解释造成不好的影响。此外，如果因为某些问题测定过程要中断，需要决定重新测定这些样品还是用新的样品来测定（样本较少时更加受限）。有研究对6天内尿液QC样品放在4℃自动进样器的稳定性进行了的每天测量表明，QC样品在48h内是稳定的，因为这是样品保存在这个环境下的最长时间，不同样品会存在差异，需要根据实际情况分析稳定性和检测中断后需要采取的措施。
参考文献
Want, E. J., I.D. Wilson, H. Gika, G. Theodoridis, R. S. Plumb, J. Shockcor, E. Holmes and J.K. Nicholson (2010). "Global metabolic profiling procedures for urineusing UPLC-MS." Nat Protoc5(6):1005-1018.
文献之声是博淼生物围绕基因组学、蛋白质组学、代谢组学最新发表且有影响力的SCI文献进行详细解读，展示对应的研究路线、创新研究亮点、研究成果讨论等等，目的在于让科研老师及时了解所属研究领域最新的研究动态及成果，从而引燃其课题研究的创新之火。
博淼生物可提供如下代谢组学技术服务：
1、非靶向代谢组技术服务—核磁共振、LC-MS/MS、GC-MS、CE-MS、脂质
2、拟靶向代谢组技术服务
3、代谢轮廓分析技术服务—胺类物质检测、肉碱分析、花生四烯酸类代谢物分析
4、靶向代谢组技术服务—甾休靶向检测、鞘脂靶向检测、修饰核苷定量检测、胆汁酸定量检测、氨基酸定量检测、定制代谢物靶向检测