Neuroanatomy goes viral-神经科学（标记篇）
中国脑计划将于月底正式推出（2017-2030--14年预计投资200亿），《“十三五”国家科技创新规划》发布，指明重点任务--突破若干前沿关键技术---其中脑科学和类脑人工智能为其中一项技术。
技术前半部分：发展脑连接图谱绘制、神经网络活动实时记录和调控、神经元类型及其特异性神经环路结构及功能解析等技术，以研究脑结构与功能、工作原理等方面--也就是神经标记和神经环路示踪技术、光遗传学技术、化学遗传学技术、显微镜内活体钙成像技术等，这些技术部分或全部依赖病毒工具。
大家都知道，功能研究的前提是结构，了解神经元（环路）结构首先进行神经解剖学分析，拿到解剖图谱。在神经解剖学的研究中，最根本的技术就是标记和成像观察技术。人类只有借助不断发展的标记和观测技术，获得更细致地观察，才能更好地理解它的功能、研究它的状态。以卡哈尔采用改良银染法开拓现代神经科学为开端，神经解剖技术让我们清晰地看到了大脑的组织结构；20世纪70年代之后的示踪技术趋于成熟，各类示踪剂以及病毒的应用为神经解剖学的研究带来了质的飞跃；近年来，基于病毒的神经示踪技术、透明脑、全脑成像（MOST，光片技术），电镜重构等现代技术，科学家们在各个层面更进一步地推动神经解剖的发展，为神经科学的发展铺就坚实的基础。
今天小编就标记给大家上几道硬菜。
历史回顾
1、20世纪初-高尔基染色
高尔基银染法是跨时代的，但不足以支撑对神经元更深入、更细致的研究，染色的方法既不能揭示神经纤维之间的联系，也不能界定特定神经元的完整分布区域。多个神经细胞的轴突、树突交叉在一起时，很难判断一段神经纤维属于哪一个或哪一群胞体；况且切片后的神经组织难以观察到完整的神经元。
2、20世纪70年代-蛋白类标记与示踪
2.1.常用于神经标记及示踪的荧光染料有固蓝、荧光金、羰化青等。由于不同荧光剂对不同神经纤维或不同细胞组分的亲和力不同，故可以使用两种或多种荧光剂进行荧光双标或多重荧光标记。因为荧光染料的检测无需使用复杂的组织化学方法，只需使用荧光显微镜即可进行观察，所以应用较为广泛。荧光染料存在的问题为在激发光下会发生荧光淬灭而造成褪色，样本无法进行反复、长时间观察--比如CTB逆行
2.2.辣根过氧化物酶HRP注射至中枢神经系统或周围神经的一定部位，可被神经末梢以胞饮的方式摄入，逆行运送至胞体，可以通过组织化学方法进行显色。HRP的活性随着时间而衰减，但是在细胞里的扩散距离随着时间而增加，注射后的最佳检测时间在2到5天左右。但由于HRP参与细胞代谢，在细胞内停留时间短，并且容易扩散到周围的细胞造成污染，所以目前的应用大大减少。
2.3.小麦凝集素WGA通过细胞膜上特异性受体介导而被胞饮入神经元内-顺行
2.4.1992年，Veenman等人首次使用BDA作为顺行示踪剂并验证了它较好的效果。葡糖聚氨和它的结合物可以被树突或神经细胞胞体吸收，其原理至今依然无法解释。BDA示踪保存时间较长，制备好的样品可以保存6个月以上，可以与多种荧光追踪剂和免疫组织化学方法结合，比传统的方法更加灵活。
然而传统的标记与示踪剂并不是完美的。人们认为，理想的示踪剂需要具备如下五点特性：第一，它能特异性且高效得被神经元细胞吸收；第二，它能靶向一类特定的动力蛋白，表现出特异地顺行或逆行传导；第三，它的信号可视化且能够被稳定地放大；第四，其可应用多种颜色以便使用多种示踪剂；第五，一些示踪剂可以信号不衰减地跨突触传递。
3、20世纪末-病毒标记与示踪
嗜神经病毒是一类可以感染神经细胞，且能沿神经环路增殖传播的病毒。20世纪末，人们已经开始改造并利用这类病毒的疫苗株作为全新的示踪剂，且一直沿用至今，成为了目前最高效的一类示踪剂。嗜神经病毒在细胞特异性、示踪效率、跨突触示踪方面显著优于传统示踪剂。
目前常用的神经环路示踪系统，主要是可分为3大类：
（1）疱疹病毒科的伪狂犬病毒和单纯疱疹病毒；
（2）弹状病毒科的狂犬病毒和水疱炎病毒；
（3）为限制跨突触病毒感染和传播范围的辅助病毒，包括腺相关病毒、逆转录病毒和慢病毒等
基于这些病毒的结构、感染及复制特性，利用反向遗传学及同源重组等手段，筛选和改造病毒，减弱毒力，插入荧光蛋白等外源基因，初步满足逆向跨单突触（RV+AAV）和多突触(PRV)、正向跨多(HSV)、单突触(HSV+AAV)传播的示踪系统，成为神经环路研究的有力工具。
能够跨突触的病毒示踪剂常使用的主要有两类，分别是疱疹病毒和弹状病毒。这类病毒因为保留了病毒的复制能力，相应地，其拥有快速的感染能力和不小的毒性。疱疹病毒最常用的是逆行示踪的伪狂犬病毒（PRV）的Bartha strain和顺行示踪的α-疱疹病毒HSV-1 strain H129。
传统示踪剂和普通的病毒示踪剂无法解决的一个问题是示踪剂无法特异性地选择指定神经元。于是人们在疱疹病毒示踪剂上首次使用了CRE-LoxP系统加以实现。2001年，DeFalco等利用了CRE-dependent PRV实现了选择性标记特异类型神经元的输入环路，使得病毒只能从指定神经元开始逆行示踪。但PRV的缺点在于，无法感染灵长类动物神经。于是人们采用弹状病毒来完成对灵长类动物的研究。弹状病毒主要有逆行示踪的狂犬病毒（RV）和顺行示踪的水泡型口炎病毒（VSV）两类。
普通跨突触病毒示踪剂用神经元细胞存活时间来判断级联关系，然而考虑到细胞的自身特性和病毒的剂量，且伴随着时间的流逝，神经通路的复杂性使得判断变得不够准确。Wickersham等利用RV疫苗株Sad B-19构建了能够实现跨单突触的示踪剂。该示踪剂同样用到了Cre-LoxP重组技术和AAV病毒载体等工具，为现代复杂神经环路示踪等神经科学研究奠定了基础。
► RV病毒跨单突触示踪技术设计草图
不能跨突触的病毒示踪剂又可根据病毒的种类分为逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒等，适合作为表达外源基因的载体。逆转录病毒会将基因组整合进神经元细胞基因组，表达稳定长效；但是滴度与其他病毒相比略低。腺相关病毒滴度高、表达稳定长效、几乎无毒，且可以用同源重组进行编辑，是实验室广泛使用的一类；缺点是能够携带的外源基因较小，长度在4.8kb左右。腺病毒滴度高、感染迅速，也同样可以运用重组编辑；但病毒的衣壳蛋白会引起炎症反应。
跨突触的嗜神经病毒虽然标记与示踪效果很好，但由于其毒性，出于安全考虑，病毒注射必须在BSL-2实验室操作，另外其跨突触的级数不确定，这2个因素限制其广泛应用，不过大家只要找到二级实验室，做好预实验，还是可以拿到非常好的数据；另外腺相关病毒AAV安全无毒，近年来发展迅猛，人们利用其开发出更多的标记与示踪系统。
4、目前发展最快的病毒：AAV
4.1、顺行标记
目前神经科学研究（小鼠+非人灵长类CNS神经元标记）主要是用到9型AAV，该血清型对各个脑区（包括皮层）神经元 转导效率都比较不错；当然其它血清型也有人在用。
这种非特殊改造的AAV感染神经元胞体后原位表达，沿着fiber可以顺向投射到下游脑区（非跨突触），可用于投射研究。
这里有几个数据供大家参考；rAAV9对皮层转导最有效，对海马转导也不错；而rAAV5对纹状体转导效率特别高；rAAV8对星型胶质细胞的转导效率特别高，可能是由于特定的细胞类型表面有高浓度特异血清型依赖的受体。
对于细胞类型特异性的表达，除考虑血清型外，一般采用特异启动子（如下图：利用CamkII启动子可实现对兴奋性神经元的转导)。
利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨单突触系统研究杏仁核基底外侧核后部至腹侧海马CA1区之间存在丰富的谷氨酸能兴奋性单突触输入
另外采取Cre策略（前文有提示，1、cre小鼠+AAV-dio; 2、双病毒策略AAV-Cre+AAV-dio--启动子足够特异）
化学遗传学（cre小鼠+AAV-dio）研究DRN 5-HT神经元特异性激活削弱对迫近性威胁刺激的反应
光遗传学（双病毒策略AAV-Cre+AAV-dio）来调节多巴胺的活性和猴子的选择行为
星形胶质细胞是大家研究的热点，但是要想实现特异性标记，非常困难；其中GFAP 启动子能够驱动效应基因在星形胶质细胞中特异性地长时表达，并被广泛用于动物实验。
当其用于AAV和LV等病毒载体时需要考虑以下问题：1）组织交叉性，即病毒载体的组织和细胞嗜性；2）反向末端重复序列ITRs的转录元件的影响。含GFAP启动子的AAV2在脊髓和海马神经元内亦有表达，这种广泛的非特异性表达可能与病毒本身对神经元的嗜性有关。含GFAP启动子的LV转导含神经元和astrocyte的小鼠大脑皮层培养物，目的基因在astrocyte内特异表达。但是，体内实验中同样观察到了神经元的标记。
换句话说，脑区细胞特异性标记（除神经元细胞标记相对一致外）目前莫衷一是：脑区、启动子、病毒血清型等因素均要考虑。大家实验中有没有标记效果好的经验，欢迎分享，利己利人，小编会多收集，给大家分享。
4.2、逆行标记
逆行标记常用的有染料CTB、Retrobead；嗜神经病毒PRV(3-5天)/RV(7-12天）/CAV(狗腺病毒-2周到6个月)/EIA(马传染性贫血病毒，感染神经元后可以逆行传播，持续稳定的表达目的基因，而没有毒性)
对于rAAV轴突吸收,逆行运输至上游核团胞体，最近几年才有报道；另外注射剂量若较高，正常的rAAV也会出现逆轴突运输现象，这点大家要注意。
有报道称rAAV5可以沿着轴突选择性逆向从齿状回区转运至内嗅皮层腹侧部（高度特异性）；rAAV1注射至海马，可以逆向标记内嗅皮层神经元。
另外rAAV6注射至纹状体可以逆向标记至皮层，黑质，丘脑；注射至丘脑可以逆向标记至皮层，黑质；
分析可能存在细胞类型特异性调节的轴突运输因子，或受体分子通过某种方式交换至轴突末端，找到决定因素将利于发展新的特异性靶投射方式，改造更多的逆行运输AAV；目前逆行标记常用的是rabies和retro-AAV
4.2.1、Rabies:RV-EnvA（逆向跨单突触）和RV- dG（仅逆向标记，不跨突触）两个子类。RV感染CNS后主要标记神经元，几乎不标记胶质细胞，对没有突触连接的神经纤维不感染，毒性低，被感染的神经元几乎不发生明显的病变及裂。RV注射后一般以10天为标准时间牺牲动物，亦可控制在7-12天（实验窗口期严格一致）。注意： RV-EnvA系列需要与AAV helper配合使用。RV系列病毒操作需要在BSL-2实验室进行。
利用AAV和狂犬病毒RV逆向跨单突触系统研究视觉刺激引起先天恐惧的大脑环路
4.2.2、rAAV2/Retro：2016年9月份Neuron报道了Alla Y. Karpova实验室D.Gowanlock R.Tervo等人的工作。研究人员通过In Vivo文库筛选的方法获得了一种新的AAV血清型，这种血清型对于神经元投射的逆向标记效率比经典血清型提高了100倍以上，甚至可以达到染料和Retrobead类似的逆标效率。更重要的是逆标过去的AAV可以轻松表达出所携带的目的基因，做以往很难实现的各种操纵。注意：该病毒要求的注射滴度较高；但是也有一些局限，目前来看，这种筛选方式拿到的病毒对皮层的标记效率较高，对其余核团标记效果不一定好，需要尝试。
4.3、跨突触传导
我们知道嗜神经病毒很容易跨突触沿着下一级传导，但是跨突触机制，病毒跨突触的过程及对各类型突触结构选择性并不清楚；rAAV的跨突触报道较少，下面分享2篇，供参考。
4.3.1、顺行跨单突触：今年初Neuron 报道了AAV顺行跨突触应用的新突破。Zingg et al.采用了AAV2（ITR）/1(血清型）-Cre顺行跨突触示踪。研究结果展示了AAV2/1的顺行跨突触传播能力。实验中，AAV1-Cre能有效转导突触前神经元，Cre表达于特定的突触后神经元，沿轴突实现顺行标记。注意AAV1-Cre要求注射滴度较高。
作者将AAV2/1应用到上丘(superior colliculus, SC)神经元，操作起始神经元胞核及其下游的二级通路，发现SC神经元可以接受来自听觉和视觉皮层的皮质下丘投射，介导着逃离和冻结两种不同的防御行为。AAV顺行跨突触病毒工具极大拓展神经科学的研究思路，并得到广泛应用，尽管如此，跨突触的机制，我们目前仍不清楚。
AAV1型病毒运载CRE /flp 顺行跨一级突触，实现对下游特异类型神经元的标记、活动操控以及记录等
4.3.2、逆行跨单突触
2013年曾有篇science 报道，利用2种AAV实现逆行跨单突触传导（如下图），一种是重组酶（比如cre）依赖表达TetTox，一种是跨神经元分子（如WGA或者TTC）连接的cre酶，但是这种方法效率较低，稳定性差，并且逆行和顺行转运在理论上都是可能的，没有得到广泛使用，唯一好的是没有毒性，可以带功能基团，大家都可以尝试。
另外还有中枢系统- 稀疏高亮标记、精细标记、细胞多色标记、全脑细胞标记（PHPB/PHPeB）、三级及三级以上脑区标记、药物依赖的时空特异性标记、活动依赖的启动子特异性标记、新生神经元标记、神经干细胞标记; 外周PNS（PHP.S-脊髓、肠道；神经肌肉接头、DRG）标记等、树鼩及非人灵长类大脑（NHP）标记等，后续给大家一一道来,敬请期待！
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来源：基因疗法最前沿
作者：dragon heart
编辑：格格
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