基于网络药理学的黄芪治疗肾病综合征的机制研究

摘 要：目的  运用网络药理学的方法探讨黄芪治疗肾病综合征（NS）的分子作用机制。方法 通过TCMSP数据库和文献挖掘获取黄芪主要活性成分，利用PharmMapper服务器、GeneCards和CoolGeN数据库预测和筛选黄芪活性成分的作用靶点。采用String数据库和Cytoscape软件绘制蛋白相互作用网络，通过Systems Dock Web Site对成分与靶点进行分子对接验证。借助DAVID数据库对靶点进行GO分析和KEGG通路分析，采用Cytoscape软件构建成分-靶点-通路-疾病网络。结果 筛选得到黄芪25个活性成分，涉及47个作用靶点。网络分析结果表明，靶点主要涉及氧化应激、足细胞凋亡和脂质代谢等生物过程，通过调节Ras、Rap1、MAPK、PI3K-Akt和AGE-RAGE等信号通路来发挥治疗NS的作用。结论 黄芪中黄酮类、皂苷类等活性成分可能是其治疗NS的物质基础，其作用机制涉及抗细胞凋亡、抗氧化应激和调节脂质代谢等。

肾病综合征（NS）是儿童和成人中最常见的肾脏疾病之一，其临床特征主要是大量蛋白尿、低蛋白血症、高脂血症和全身性水肿^[1]。NS发病机制非常复杂，主要与足细胞损伤与凋亡、脂质代谢紊乱和氧化应激等有关^[2-4]。目前NS的治疗仍以化学药物为主，但化学药会引起严重的毒副作用以及并发症^[5-6]。而中医注重整体调节，毒副作用较小，研究发现防己黄芪汤、当归补血汤和参芪地黄汤等复方皆以黄芪Astragali Radix为君药，在治疗肾病方面疗效显著^[7-10]。黄芪始载于东汉末年的《神农本草经》，为豆科多年生草本植物，基原有蒙古黄芪和膜荚黄芪，是一味重要的传统中药，其用药历史迄今已有2 000多年，其味甘、性温，具有补气固表、利水消肿、托毒生肌等功效，是中医治疗“肾病水肿”的常用药物^[11-13]。近年来研究发现^[14-15]，单味药黄芪可以减少尿蛋白而减轻肾脏的损伤。临床研究发现^[16]，NS患者的氧化应激增强，而黄芪具有一定的抗氧化作用。虽然黄芪干预NS的疗效比较明确，但存在分子机制不明确的问题，仍需要进一步研究探索。因此，本研究以人类常见疾病靶标为研究对象，基于反向分子对接技术研究黄芪治疗NS的作用机制。

由于中药多成分、多途径和多靶点的特点，很难明确药效物质基础及作用机制。许多学者尝试用现代医学解释中药的作用机制。网络药理学^[17]这一概念于2007年由英国药理学家Hopkins率先提出，基于系统生物学和多向药理学等多学科理论，从多维度视角理解药物干预疾病的分子机制。已有研究表明，通过网络药理学的方法研究中药的作用机制符合中医药的整体作用特点，方法准确可靠。如已有学者利用网络药理学方法研究脑震宁颗粒干预脑外伤的作用机制^[18]、柴胡的抗抑郁作用机制^[19]、款冬花止咳化痰的作用机制^[20]。本研究以黄芪的25个成分为基础，运用网络药理学方法构建成分-靶点-通路-疾病网络，探讨其多成分、多靶点、多通路的作用机制，为黄芪治疗NS作用机制深入研究奠定基础。

1  材料和方法

1.1  黄芪化学成分的收集及筛选

黄芪的化学成分从TCMSP数据库^[21]（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）中获取，输入关键词“黄芪”，得到活性成分信息。本研究通过口服生物利用度（OB）和类药性（DL），筛选出同时满足OB≥30%和DL≥0.18的化学成分以及文献报道的有活性的成分^[22]。

1.2  预测潜在靶点

登录反向药效团匹配数据库PharmMapper（http://59.78.98.102/pharmmapper/index.php）筛选得到黄芪候选成分的mol2格式文件，下载计算结果。提交后获得PDB ID、靶点名称（target name）和得分（fit score），其中fit score为分子和靶点的匹配度，越高代表越匹配。选取fit score＞3的靶点蛋白作为该化合物的靶标蛋白，并用UniProt数据库（http://www.uniprot.org/）输入筛选获得的蛋白靶点PDB ID，经检索和转化操作得到的黄芪主要成分的潜在作用靶点。

通过在CooLGeN（http://ci.smu.edu.cn/ CooLGeN/）和GeneCards（https://www.genecards. org/）数据库中输入关键词“nephrotic syndrome”搜索已报道与NS相关的基因，去除重复基因和假阳性基因，与上述成分靶点匹配分析，筛选与黄芪活性成分相关的作用靶点。

1.3  蛋白相互作用网络构建与分析

String数据库^[23]（https://string-db.org/）收集了大量蛋白相互作用关系，通过将黄芪的蛋白靶点导入String数据库，限定物种为人，进行蛋白互作分析。为确保数据的可靠性，选取0.7的高置信度，保存结果。将导出文件中的node1、node2和combined score信息导入Cytoscape软件绘制相互作用网络，并对网络进行分析，并将节点（node）大小设置用于反映度值（degree）的大小，边（edge）的粗细设置用于反映combined score的大小，获得最终的蛋白相互作用网络。

1.4  分子对接

Systems Dock Web Site^[24]（http://systemsdock. unit.oist.jp/iddp/home/index）是一个基于网络药理学预测和分析的网络服务器，用于说明配体如何作用于复杂的分子网络。采用Systems Dock Web Site对蛋白相互作用网络中度值靠前的5个靶点与黄芪主要药效成分进行分子对接验证。保存分子对接结果，并对其docking score进行分析，用以评价黄芪活性成分与靶点之间的结合活性。并用临床上广泛应用于治疗NS的药物他克莫司（Tacrolimus）进行对照分析，整理对接结果中的docking score并分析。

1.5  生物过程与通路分析

将黄芪的作用靶点导入DAVID数据库，selectidentifier设置为officialgene symbol，list type设置为gene list，限定物种为人，对黄芪作用靶点进行GO分析和KEGG通路分析，保存结果。设定阈值P＜0.05，并按照涉及的靶点数目多少进行排序，筛选排名靠前的生物过程或通路，用GraphPadPrism 5绘图。

1.6  成分-靶点-通路-疾病网络构建

将25个药效成分的预测靶点结果和通路分析，在Excel表中分别构建“药材-药效成分”“药效成分-靶点”“靶点-通路”和“通路-疾病”之间的相互关系，图中以药材、药效成分、靶点蛋白、通路和疾病为5类节点，它们之间有相互关系的分别用边相连，采用Cytoscape 3.6.1软件的关联（Merge）功能构建黄芪-成分-靶点-通路-疾病网络模型。

1.7  靶点通路分析

利用KEGG（https://www.kegg.jp/）数据库KEGG mapping中的Search Pathway，输入黄芪与疾病相关的靶点蛋白，获取黄芪治疗NS的通路图，筛选前10条通路并整合绘制最终的通路图。

2  结果

2.1  黄芪活性成分的筛选

在TCMSP数据库中，根据OB、DL值筛选到符合此条件的20种化学成分，连同文献报道的有活性的成分5种，共25种，结果见表1。虽然部分成分（黄芪皂苷和甜菜碱）^[25-26]DL值较低，但研究显示这些成分有明显的药理作用，并且在肾病方面有独特疗效，因此将这些成分也纳入后续的研究中。

2.2  作用靶点预测

将PharmMapper数据库得到的所有靶点，删除重复并去除假阳性，整合得到黄芪活性成分作用靶点337个。通过与GeneCards和CooLGeN数据库中与NS相关基因进行比对，筛选出47个可能与治疗NS相关的作用靶点（表2）。

2.3  蛋白相互作用网络构建与分析

将筛选到的靶点输入String数据库中，限定物种为人，将结果导入Cytoscape软件得到靶点之间相互作用网络，见图1。图中节点表示蛋白，边表示蛋白之间的关联，共涉及47个节点，282条边。图中节点的大小表示度值的大小，节点越大，对应的度值越大。边的粗细表示combine score，边线越粗combine score值越大。其中排名前5的蛋白包括ALB（40）、SRC（27）、IGF1（26）、IL2（25）和MMP9（23）。

2.4  分子对接

在蛋白相互作用网络分析中，一般认为具有很高度值的节点，为所有节点的“中枢节点”，在整个网络中占据重要地位。将上述排名前5的靶点与表1中排名前9的活性成分及阳性对照药Tacrolimus进行分子对接验证，对接结果见表3。一般认为dockingscore值在4.25以上时表示分子与靶点之间有一定的结合活性^[26]，大于5.0表明分子与靶点有较好的结合活性，大于7.0则说明具有强烈的结合活性。分子对接结果表明，黄芪主要活性成分与重要靶点的结合性好，且与阳性对照药Tacrolimus的docking score值较接近。

为明确靶点蛋白与所对应成分之间的结合活性，本研究选取2个打分较高的关键靶点白细胞介素-2（IL2）和基质金属蛋白酶-9（MMP9）与黄芪中关键成分黄芪甲苷（astragaloside IV）和阳性药Tacrolimus进行分子对接分析，结果见图2。结果显示，黄芪甲苷和阳性药Tacrolimus与IL2和MMP9对接得分，均高于结合IL2和MMP9的天然配体（3.98和4.84）。例如黄芪甲苷与MMP9有4个结合位点，故对接得分较高，且黄芪甲苷与阳性对照药Tacrolimus 的docking score值较接近。

2.5  基因功能和通路分析

将黄芪活性成分预测出的47个作用靶点通过DAVID数据库进行GO分析和KEGG分析。GO富集分析（图3）包括生物过程（biologicalprocess）、细胞组分（cellularcomponent）、分子功能（molecularfunction）。生物过程涉及细胞凋亡的调节、细胞内信号级联、系统过程的调控、氧化应激反应、细胞增殖的调控等方面；细胞组成涉及质膜、细胞质、细胞质囊泡等方面；分子功能涉及内肽酶活性、钙离子结合、脂质结合、蛋白激酶活性、酶抑制剂活性、类固醇结合等方面。通路分析结果如图4所示，黄芪治疗NS主要涉及Ras信号通路、Rap1 信号通路、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路、relaxin 信号通路、AGE-RAGE信号通路等。

2.6  黄芪-活性成分-作用靶点-通路-疾病网络构建

采用Cytoscape软件构建黄芪-成分-靶点-通路-疾病的网络模型。该网络有59个节点（包括1个药材、25个成分、20个靶点、12条通路和1个疾病）和203条边（图5）。其中V字形节点代表药材和疾病、菱形节点代表成分、三角形节点代表靶点、圆形节点代表通路、边代表相互作用关系。度值在网络分析中是比较重要的，度值越大说明与之相连的节点数越多。图中菱形节点代表成分，其大小与度值相关，节点越大代表成分的度值越大，结合表1中所列的成分度值可知，黄芪皂苷（astragaloside I、II、III、IV）、异鼠李素（isorhamnetin）、山柰酚（kaempferol）等成分的度值较大，因此可能是发挥药效的成分。三角形节点代表靶点，其面积大小与度值相关，节点面积越大代表节点度值越大，图中RAC1、KDR、MMP9和SRC节点较大，提示可能是黄芪干预NS发挥作用的靶点。圆形节点代表通路，靶点富集的越多，节点越大，显示出Ras、Rap1、PI3K-Akt和MAPK等通路节点较大，代表这几条通路的重要性。

2.7  黄芪潜在作用靶点途经分析

将黄芪治疗NS的47个潜在作用靶点通过KEGG数据库进行通路注释分析。利用KEGG Mapper工具获取黄芪治疗NS的通路图，筛选靠前的几条通路并进行整合绘制最终的通路图（图6）。通路靶点标记为长方形，黄芪治疗NS的靶点标记为椭圆形。图中显示出了Ras、Rap1、PI3K-Akt、MAPK、VEGF、TNF等信号通路，涉及18个治疗NS的靶点。提示黄芪治疗NS靶点分散于这几条通路中，绝大多数靶点在多条通路中发挥作用，如SRC、RAS、RAC和CASP3等。

3  讨论

本研究借助网络药理学的方法，探讨黄芪治疗NS的物质基础及其分子机制，发现其通过调节Ras、Rap1、MAPK、PI3K-Akt等多条通路发挥保护肾脏的作用。此外，发现黄芪中黄芪皂苷成分和黄酮类成分具有较大的度值，因此黄芪治疗NS的主要物质基础可能是皂苷和黄酮类成分。

黄芪具有利水消肿的作用，是治疗NS的重要药物，以其为主要药物的复方在NS治疗中占了绝大比例，因此，黄芪治疗NS的研究具有重要意义。黄芪中的黄芪皂苷、黄酮类（异鼠李素、槲皮素、山柰酚）、甜菜碱（betaine）等多个成分均已报道具有治疗肾脏疾病的作用。陈吉刚等^[26]研究发现甜菜碱可能通过减轻内质网应激及相关的炎症反应治疗糖尿病肾病小鼠。黄芪皂苷提取物^[27]对糖尿病肾病大鼠具有一定的肾脏保护作用。而黄芪甲苷是皂苷类最主要的成分之一，黄芪甲苷^[28]治疗阿霉素肾病，可能与足细胞氧化应激反应的减少有关。作为黄酮类成分异鼠李素^[29]对糖尿病肾病大鼠的肾脏保护作用，可能与抑制肾小球系膜细胞中的核转录因子-κB（NF-κB）信号传导活性，减少炎症介质的产生和减弱氧化应激有关。槲皮素^[30]可减少炎症细胞浸润，同时可以显著减少肾小球和肾间质实质细胞损坏。山柰酚^[31]通过调控p38 MAPK信号通路，对高糖环境下大鼠肾系膜细胞起到保护作用。此外本课题组^[32]前期通过代谢组学方法研究黄芪总黄酮对阿霉素诱导的肾病综合征模型具有一定回调作用，与本研究网络药理学预测相互佐证，可证明结果的准确性。

采用反向分子对接的方法预测活性成分的作用靶点，并结合相关数据库，筛选得到47个与NS相关的作用靶点。其中，基质金属蛋白酶（MMP）是一组特定的酶，通过锌依赖性蛋白质水解进行细胞外基质降解。MMP-2和MMP-9在足细胞损伤中具有关键作用，足细胞迁移和阿霉素诱导细胞损伤可能与MMP-2和MMP-9表达的上调有关^[33]。Sai等^[34]发现阿霉素诱导的足细胞损伤组MMP-2和MMP-9表达水平均下降，而黄芪甲苷干预组能够抑制这种下降，防止足细胞的损伤。Ras相关的C3肉毒杆菌毒素底物1（Rac1）参与纤维化疾病的病理生理学，研究显示Rac1在缺血再灌注损伤后的肾纤维化中起关键作用^[35]。各种半胱氨酸蛋白酶（Caspase）^[36]参与细胞凋亡过程，Caspase一旦被激活，就在细胞内信号级联中发挥关键作用，从而发生凋亡。研究发现山柰酚抑制Caspase的活化^[37]，从而减轻内质网应激引起的细胞凋亡。

靶点GO分析结果表明，靶基因涉及细胞死亡调控、调节细胞增殖和氧化应激等生物过程；涉及细胞质、细胞膜等细胞组分；涉及脂质结合、蛋白激酶活性和钙离子结合等分子功能。提示黄芪治疗NS可能通过调控足细胞的生成、增殖和抑制氧化应激诱导的足细胞凋亡；对细胞膜的调控可能与脂质调控有关。足细胞损伤被认为是肾小球滤过屏障功能障碍引起的蛋白尿发展的最关键因素之一，连续损伤可能导致严重的细胞凋亡^[38]。黄芪水提物^[39]通过抑制氧化应激和内皮型一氧化氮合酶，改善阿霉素肾病大鼠的蛋白尿。NS的临床表现为高胆固醇、高血脂和低蛋白血症，研究发现与脂质代谢紊乱有关^[3]。刘超等^[40]发现黄芪具有调节血脂代谢和提高抗脂质过氧化的能力。这与本研究预测结果一致，为本课题组研究黄芪对阿霉素诱导的NS脂质代谢紊乱的调节起到指导作用。并且为黄芪治疗NS提供理论依据以及为未来的相关研究提供了基础。

事实上，Ras和Rap1通路与MAPK、VEGF、PI3K-Akt和TNF信号通路均有关联。提示Ras和Rap1通路在黄芪治疗NS的过程中发挥重要作用。Potla等^[41]发现足细胞中Rap1信号传导的减少会诱发小鼠严重的肾小球疾病，并与人类肾小球疾病的发病机制有关。PI3K/Akt在细胞中广泛存在，对细胞增殖、分化、凋亡和代谢的调节至关重要^[42]，PI3K/Akt信号通路在足细胞凋亡的抗性中起关键作用^[43]。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK），包括ERK、JNK和p38，是一系列丝氨酸/苏氨酸激酶，可调节细胞增殖和凋亡^[44]。黄芪甲苷通过MAPK途径减弱补体膜攻击复合物诱导的足细胞损伤^[45]。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）是一种有效的促炎细胞因子，它通过促进炎症和细胞凋亡而与肾损伤的发病机制有关，在糖尿病肾病中，肾小管上皮细胞的凋亡与TNF-α表达相关，导致肾小管萎缩和随后的肾小管间质纤维化^[46-47]。

本研究基于网络药理学方法对黄芪治疗NS的活性成分和作用机制进行了分析，并通过Systems Dock Web Site分子对接软件验证黄芪活性成分与重要靶点之间存在较好的结合活性，验证了网络药理学预测靶点的可靠性。建立成分-靶点-通路-疾病网络发现，黄芪中皂苷类化合物、黄酮类化合物、甜菜碱、亚麻酸等药效成分可能通过抑制氧化应激反应减轻足细胞损伤，通过Ras、Rap1、MAPK、TNF和PI3K-Akt信号通路调节足细胞增殖与凋亡而发挥治疗的作用，说明中药多成分-多靶点-多通路治疗疾病，为发病机制复杂的NS提供了研究方向。此外，本课题组正在进行黄芪的活性成分针对NS关键靶点的相关实验研究。

参考文献（略） 

来  源：杨  柳，张王宁，刘月涛，李爱平，秦雪梅. 基于网络药理学的黄芪治疗肾病综合征的机制研究 [J]. 中草药, 2019, 50(8):1828-1837.