归肾经补阳药的网络药理学机制研究

摘  要：目的  运用网络药理学的方法对归肾经补阳药的分子作用机制进行预测。方法  选择归肾经补阳中药肉苁蓉、菟丝子、冬虫夏草、韭菜子、沙苑子、仙茅、续断以及胡芦巴作为研究对象，通过TCMSP数据库检索中药化学成分，利用口服生物利用度（OB）、类药性（DL）值筛选活性成分及PubChem数据库的化学相似性靶点预测方法对中药活性成分进行靶点预测；通过STRING数据库寻找归肾经补阳药靶蛋白之间的相互作用关系以及KEGG通路分析；通过加权PageRank算法评价蛋白互作（PPI）网络中的节点，并对信号通路进行打分。基于通路富集分析及PPI分析筛选核心靶蛋白。利用Cytoscape 3.6.0软件，分别构建化合物-关键靶点网络、药材-关键靶点PPI网络和关键靶点-通路网络，并对其作用机制进行了初步探讨。结果  筛选出归肾经补阳药核心靶蛋白21个，信号通路40条。归肾经补阳中药可能通过T细胞调节、性激素调节、免疫反应、延缓衰老等途径发挥温补肾阳的作用，其作用机制可能与甲状腺激素、神经营养因子、TNF及雌激素等信号通路有关。结论  基于网络药理学的研究方法有助于寻找归肾经补阳药的关键靶点和信号通路，为深入诠释补肾阳药的分类含义提供有益的信息和数据支撑。

肾阳虚证是中医常见证候之一。肾阳虚患者常表现出腰腿酸软、四肢乏力、夜间多梦、气短盗汗，部分患者出现阳痿早泄、不孕不育。目前研究发现肾阳虚证主要与神经、内分泌、免疫功能异常有关。归肾经补阳中药能温补人体一身阳气，普遍应用于肾阳虚证的治疗。现代药理研究表明该类中药具有广泛的药理活性：增强免疫功能、性激素样作用、抗衰老、抗氧化、抗肿瘤、抗骨质疏松等作用^[1]。但这类中药具体的靶标及分子机制尚不明确，有待进一步研究。

传统药物单靶点的研究模式无法解释中药多成分、多靶点协同作用机制，使中药研究在现代化进程中步履维艰。随着网络药理学的兴起，其整体性、系统性的特点有望揭示中药中不同成分之间的协同效应，阐明中药理论的奥秘，目前已被广泛应用于中药复方研究中^[2-5]。Liu等^[6]应用系统药理学方法分别构建了补气类和补血类中药-活性化合物-靶点-疾病网络，用以探究补气类和补血类中药治疗多种复杂疾病的分子机制；佘甘树等^[7]运用计算机网络药理学技术对活血化瘀类中药所含化学成分的抗凝血作用机制进行预测。研究结果显示网络药理学方法应用于中药药效分类研究具有显著优势，与传统实验研究相结合可谓优势互补。

本研究采用网络药理学方法，对临床常用且药效确切的8味归肾经补阳药进行研究和分析，从多维度寻找其共性，探索其分子作用机制，为归肾经补阳药后续研究提供依据，并为中药药效分类的深入诠释和解析提供一种新思路和新方法。

1  方法

1.1  归肾经补阳药的选择及活性成分筛选

《中药学》^[8]中记载了25味典型补阳药并且100%归足少阴肾经，以临床常用且治疗效果明确为依据，从中选择8味植物药作为研究对象，分别是肉苁蓉、菟丝子、冬虫夏草、韭菜子、沙苑子、仙茅、续断、胡芦巴。利用TCMSP 2.3数据库（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmspsearch.php）收集8味中药含有的化学成分，以口服生物利用度（OB）≥30%且类药性（DL）≥0.18作为筛选标准，并将OB＜30%但具有生物活性的少数分子增补为候选活性分子。

1.2  靶蛋白的预测及蛋白名称的标准化

利用PubChem数据库（https://testpubchem. ncbi.nlm.nih.gov/），采用化学相似性搜索的靶点预测方法，对中药各活性成分按照80%～99%的相似度从高到低依次进行靶点预测，保留连续5个相似度下所有预测的靶点，构建活性成分的个数及靶点数量图，利用肘点法，判别化合物靶点预测的结果。使用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）对靶点蛋白进行名称标准化，并剔除非人类的靶点蛋白，最终获得307个靶蛋白。

1.3  归肾经补阳药蛋白互作（PPI）网络建立

为了探究归肾经补阳药靶蛋白在系统水平上的相互作用，将307个靶蛋白同时导入STRING10.5数据库中（https://string-db.org/），通过靶点删除、名称统一化等操作最终构建了包含302个靶蛋白的PPI网络。

1.4  PPI网络节点评价

PageRank算法^[9-10]普遍用于网络评价，该算法的优点^[11]是不需要预先知道一部分关键蛋白来训练分类器，而是直接通过给蛋白质打分来预测关键蛋白。本研究采用加权PageRank算法，将STRING 10.5数据库中蛋白质相互作用综合得分值（combined_score^[12]）作为权重，对PPI网络中的所有节点打分，以筛选对网络影响重大的节点，以加权PageRank值大于2倍平均值为筛选条件，得到26个潜在靶蛋白。

1.5  药材对信号通路的影响

将PPI网络中的靶蛋白导入STRING10.5数据库中进行KEGG通路分析，最终得到125条显著富集的信号通路。对信号通路上每味药材作用的基因得分求和，即为药材对信号通路影响的得分。

1.6  基于通路富集分析及PPI分析筛选核心靶蛋白

根据每味药材对信号通路的得分，计算加权得分平均值，即为补肾阳中药相关信号通路的得分。研究纳入了8味补阳药中得分高于平均值的通路40条，涉及到151个靶蛋白。结合PPI网络中的26个潜在靶蛋白，最终获得补肾阳中药21个核心靶蛋白。

1.7  网络构建及分析

将归肾经补阳药候选化合物、化合物分类、21个关键靶点及40条通路数据导入Cytoscape 3.6.0软件中，分别构建化合物-靶点网络、药材-靶点PPI网络和靶点-通路网络。

2  结果与分析

2.1  活性成分筛选结果

采用文献检索和TCMSP数据库相结合的方法查找化合物，共得到8味补肾阳中药103个化合物，其中肉苁蓉13个、菟丝子14个、冬虫夏草12个、韭菜子7个、沙苑子15个、仙茅10个、续断11个、胡芦巴21个。剔除重复项，最终获得归肾经补阳药78个候选成分。分别为黄酮类22个、生物碱类10个、萜类10个、甾体类10个、脂肪族类9个、糖苷类7个、酚类4个、苯丙素类3个、吡啶衍生物类2个以及含硫类化合物1个。化合物信息见表1。其中槲皮素^[13]、山柰酚^[14]、β-谷甾醇^[15]、芒柄花素^[16]及咖啡因^[17]等成分在多味药材中出现，具有广泛的药理活性。

2.2  靶蛋白的预测结果

利用PubChem数据库预测得到肉苁蓉、菟丝子、冬虫夏草、韭菜子、沙苑子、仙茅、续断、胡芦巴的靶点蛋白数量分别为249、204、171、82、227、265、269、185，共得到1 652个靶点蛋白，剔除重复项，最终获得307个靶点蛋白。

2.3  PPI网络的构建及评价

利用STRING数据库寻找蛋白质之间的相互作用，比较归肾经补阳药的PPI网络与人类全基因组中随机产生的相似大小的蛋白质之间的PPI网络连接情况是否有显著差异。结果见表2，归肾经补阳药蛋白质之间的连接显著，从分子生物学角度看存在共性关系。综合蛋白质数量和蛋白质相互作用得分值，本研究构建了一个包含285个节点，2 200条边的PPI网络。采用加权PageRank算法评价PPI网络中的节点，以加权PageRank值大于2倍平均值为筛选条件，得到26个补肾阳药潜在靶蛋白，见表3。

2.4  通路富集分析

KEGG信号通路富集的结果中每味药材所含的通路大体相同（相似度在80%以上），结果见表4，表明这些药材虽然直接作用的靶点不同，在生物体中却作用到同一条通路，说明归肾经补阳药具有“同病异治”的潜在分子学机制。8味药材共同的通路有81条，其加权得分平均值为0.048 430。本研究纳入了得分高于平均值的通路40条，见表5。

2.5  补肾阳中药核心靶蛋白

基于通路富集分析及PPI分析筛选出核心靶蛋白21个，基于Uniprot数据库寻找核心靶蛋白与肾阳虚证相关的分子功能，结果见表6。其中参与T

细胞相关调节、性激素的调节、抗癌或炎症反应的靶蛋白分别有8个，参与衰老过程的靶蛋白有6个。说明补肾阳中药核心功能为T细胞相关调节、性激素的调节、抗癌、抗炎，其次为延缓衰老等功能。AKT1、NFKB1、CASP3、IL1B等基因涉及到多个相关分子功能，可能是肾阳虚症分子网络中起到关键枢纽作用的靶点群。

2.6  成分-关键靶点网络

   通过Cytoscape 3.6.0构建成分-关键靶点网络，如图1所示，其中包含99个节点，810条边。绿色圆形节点代表活性成分（78个），数字编号来源于PubChem数据库的CID号，红色三角形节点代表靶点（21个），而边则表示活性成分与靶点的相互作用关系。补肾阳中药发挥药效的成分有黄酮类（22个）、生物碱类（10个）、萜类（10个）、甾体类（10个）、脂肪族类（9个）、糖苷类（7个）、酚类（4个）、苯丙素类（3个）、含硫化合物（1个）以及吡啶衍生物（2个）。其中黄酮类成分最多，平均每个化合物作用11.6个靶点，度值最大的是5280863（山柰酚，kaempferol）、5281643（金丝桃苷，hyperoside）及5280961（染料木黄酮，genistein）均为13个靶点；甾体类平均每个化合物作用7.5个靶点，度值最大的是246520（胆固醇棕榈酸酯，cholesteryl palmitate）和12304433（新替告皂苷元，neotigogenin）均为11个靶点；生物碱类平均每个化合物作用9.8个靶点，度最大的是2519（咖啡因，caffeine）有17个靶点，其次为442915（臭山羊碱，japonine）有13个靶点；萜类平均每个化合物作用10.8个靶点，度值最大的是92110（环阿廷醇，cycloartenol）有17个靶点，其次为64945（熊果酸，ursolicacid）有13个靶点。以上可以看出不同类型成分的作用靶点数目不同。所有的活性化合物都作用于至少一个或多个关键靶点，说明本研究获得的关键靶点群在所有靶点中具有代表性，可能是归肾经补阳药的主要活性靶点群。

2.7  药材-关键靶点-PPI网络

通过STRING数据库建立21个关键靶点之间的相互作用关系（combined_scores值大于0.9），通过Cytoscape 3.6.0构建药材-关键靶点-PPI网络，如图2所示，共有29个节点，157条边。粉红色圆形节点表示关键靶点（21个），绿色三角形节点代表归肾经补阳中药（8个）。补肾阳药平均作用于12.4个关键靶点，其中仙茅的关键靶点最多有17个，续断和肉苁蓉有13个关键靶点，韭菜子和沙苑子有12个关键靶点、冬虫夏草和胡芦巴有11个关键靶点，菟丝子有10个关键靶点。每个关键靶点平均关联的药材数量约为4.7个，并非每味补肾阳药都直接作用于这些关键靶点，而是通过复杂的PPI网络间接相互作用，共同发挥温补肾阳的作用。

2.8  关键靶点-通路网络

通过Cytoscape 3.6.0构建关键靶点-通路网络，如图3所示，共有61个节点，228条边。红色三角形节点表示关键靶点（21个），绿色圆形节点代表信号通路（40个），数字编号来源于KEGG数据中的通路编号，边代表靶点和信号通路之间的相互关系。归肾经补阳药主要信号通路40条，其中神经内分泌相关信号通路6条、细胞和免疫相关信号通路4条、信号转导相关信号通路5条、癌症相关信号通路14条以及感染性疾病通路11条。信号转导相关通路中度值前3位的为4010（MAPK信号通路，MAPK signaling pathway）富集了8个关键靶点，4151（PI3K-Akt信号通路，PI3K-Akt signaling pathway）和4668（TNF信号通路，TNFsignaling pathway）均富集了7个关键靶点；神经内分泌相关通路中度值前4位的为4919（甲状腺激素信号通路，thyroid hormone signalingpathway）富集了7个关键靶点、4722（神经营养因子信号通路，neurotrophin signalingpathway）富集了6个关键靶点、5010（Alzheimer’s disease，阿尔茨海默病）富集了5个关键靶点、4915（雌激素信号通路，estrogen signaling pathway）富集了4个关键靶点；细胞和免疫相关通路度值前3位的为4210（细胞凋亡，apoptosis）和4380（破骨细胞分化，osteoclast differentiation）均富集了7个关键靶点以及4062（趋化因子信号通路，chemokine signalingpathway）富集了4个关键靶点；癌症相关通路中的度值最大的是5200（pathways in cancer）富集了12个关键靶点；感染性疾病通路中的度值最大的是5142（南美锥虫病，chagasdisease）和5161（乙型肝炎，hepatitis B）均富集了8个关键靶点。补肾阳中药既可通过不同靶点与同一通路相连接，也可通过同一靶点与不同的通路相连接，说明不同的补肾阳药其靶点具有协同作用，充分体现了补肾阳中药多靶点、多通路的复杂机制。

3  讨论

肾阳虚证是中医常见症候之一，其发病机制是因肾脏阳气不足，温煦功能减弱所引起的，现代机制研究涉及神经、免疫、内分泌等多系统功能的紊乱，表现为一个复杂的、多维的分子网络失衡状态^[18]。

蛋白质分子在整个生物学过程中并非彼此独立毫不干涉，往往通过与大量生物分子的相互作用来实现一定的生物学功能。本研究尝试以网络药理学的方法，通过PPI网络对归肾经补阳药进行分析，8味药中的不同成分具有共同或相似的靶点，共同发挥温补肾阳的功效。关键靶点对肾阳虚证密切相关的T细胞功能变化、性激素水平异常、衰老等现象具有调节作用。肾虚与衰老具有共同的外部证候，肾虚证的辨证标准如腰脊酸痛、腿软、耳呜耳聋、齿落发脱、性功能减退等都是老年人生理机能衰退的表现^[19]。沈自尹^[19]提出肾虚证是未老先衰，而衰老就是生理性肾虚。T淋巴细胞是免疫系统的重要组成部分，T细胞过早、过度凋亡是T细胞数量减少及功能低下的重要机制。郭为民等^[20]研究发现2个补肾复方均能有效降低皮质酮大鼠（肾阳虚证大鼠）T细胞的过度凋亡，下调促凋亡基因FASL及TNFR1的表达，同时上调抗凋亡基因BCl-2、TNFR2、CIAP1、CIAP2的表达，抑制Caspase-8、Caspase-3的凋亡级联反应。TNFR1（TNF-α）和TNFR2（TNF-β）均是TNF作用的受体^[21]，TNF蛋白可能为补肾阳中药核心靶蛋白。

通路富集结果显示甲状腺激素信号通路、神经营养因子信号通路、阿尔茨海默病（AD）及雌激素信号通路为补肾阳中药调节神经内分泌相关的主要通路。临床研究表明^[22]，肉苁蓉总苷胶囊可以延缓中度AD患者的认知能力减退、海马体积萎缩，并降低AD患者脑脊液中总tau蛋白和炎症因子的水平。补肾阳中药肉苁蓉提取物能增加C6细胞中神经生长因子（NGF）的水平，促进PC12细胞的神经突起的延伸，刺激小鼠皮质和海马区NGF的产生，促进海马区神经细胞的分化、轴突生长和突触形成^[23]。沈自尹^[24]采用现代医学知识和方法进行“肾”本质的探索性研究，得出肾阳虚证患者下丘脑-垂体及其所辖的3个靶腺（性腺、甲状腺和肾上腺皮质）轴功能上均有一定程度的退化，温补肾阳中药治疗后，这3个靶腺功能明显恢复，提出温补肾阳中药可调整改善这3个靶腺轴上的隐潜性变化。肾阳虚证患者临床指标就性激素水平而言，表现在血清睾酮（T）浓度降低、雌二醇（E₂）浓度升高、促黄体激素（LH）浓度升高^[25]。本研究核心靶点与性激素调节相关的有AR、BRCA1、CASP3、ESR1、MAPK1、MDM2、NCOA1、PPARG。其中雄激素受体（AR）已有研究表明其浓度的降低可以作为肾阳虚证的一个诊断标准及标志^[26]，其他靶点还有待实验验证，可能也是肾阳虚证的诊断标志。补肾阳中药菟丝子提取物对雄激素部分缺乏大鼠具有生殖保护作用，能显著提高血清睾酮浓度、增加大鼠体质量、增加生殖器官睾丸的质量^[27]。

补肾阳中药活性成分主要分为5大类：黄酮类、生物碱类、萜类、甾体类以及脂肪族类，其中黄酮类占总成分的28%，5类成分共占总成分的78.2%。补肾阳中药菟丝子主要成分为黄酮类化合物，对雄性生殖系统、生殖内分泌的功能具有促进作用，具有促性腺激素（HCG）样作用^[27]。补肾阳中药性激素样作用可能的黄酮类活性成分为山柰酚、染料木黄酮、异鼠李素、金丝桃苷、毛蕊异黄酮、芒柄花素、槲皮素、沙苑子苷、山柰素、大豆黄酮、德鸢尾素、异荭草素、异牡荆苷、木犀草素、鹰嘴豆芽素A、小麦黄素、牡荆素、毛蕊异黄酮-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、黄芪苷等。其中毛蕊异黄酮^[28]、槲皮素^[29]、大豆黄酮^[30]及鹰嘴豆芽素A^[31]等绝大多数化合物已被证实具有植物雌激素作用。补肾阳中药可能通过这些成分发挥性激素调节作用。

综上，本研究首次将网络药理学方法联合加权PageRank算法应用到中药药效分类研究中，试图挖掘归肾经补阳药的特性。通过对代表性补肾阳中药活性成分的系统网络分析，发现了该类中药入体后作用的分子靶标和主要信号通路，后续将以另一种补肾阳药的网络药理学研究为切入点加以验证这项成果的准确性。本项研究尽管有一些新的发现，但还有很多局限性：①由于数据库中信息不完全，归肾经补阳药中的一些化合物可能会被忽略。②一些活性成分在筛选过程中可能会被遗漏。③并未考虑药材所含的成分入体之后的代谢转化。④肾阳虚证十分复杂，涉及面广，本研究难以全面解释其治疗肾阳虚证的作用机制。因此，在以后的研究中，针对

肾阳虚证某一种重要疾病发生机制进行网络药理学研究是必要的。

参考文献（略） 

来  源：邹家丽，李安遥，王启铭，赵  怡，于  净，项荣武. 归肾经补阳药的网络药理学机制研究 [J]. 中草药, 2019, 50(8):1838-1847.