CRISPR & AI 筛选药物靶点
Preface
i. 这是本公号第35篇胡言乱语。
ii. 科研到产业化，中间还隔着临床转化、门槛准入等环节，和大多数科研转化类似。
iii. 个人感觉CRISPR技术的能量还远远未彻底释放。另外由于技术本身开源的属性，除非能尽早开发出商业化产品并抢占先发优势进入市场，否则并不认为Editas等能从技术专利本身直接获取过高利润。
iv. 接受比特币、以太坊打赏
Bitcoin：12tzFtib6xqMmrvQ4MFiWGtxXqxak4iQQj
ETH：0xebcc1D0B2391e5CE15C51d7f294F90e999c2952C
CRISPR–Cas临床相关应用场景
CRISPR–Cas as a tool for drug discovery
a. 模式细胞；
b. 基因功能筛选；
c. 动物疾病模型；
Using CRISPR–Cas to make therapeutics(基因疗法)
a. CAR-T疗法；
b. CTLA4；
c. PD1；
d. GVHD;
国外主流公司（派系很重要）
a. Editas，张锋的专利
b. Intellia，Jennifer Doudna的专利
c. CRISPR Therapeutics，Emmanuelle Charpentier的专利
d. Egenesis Inc. 张锋的导师，Harvard、MIT双料教授，挂了不少基因大类领域的公司。和他的华人学生杨璐菡做了一家基于CRISPR-Cas9基因编辑技术的异种(🐖)器官移植临床应用公司
国内CRISPR涉及单位
a. 伯豪生物（上海），CRO，提供CRISPR-Cas9技术服务，肝癌、胃癌、乳腺癌等癌细胞miRNA敲除服务。
b. 合生基因（北京），技术服务，细胞疾病模型构建。
c. 吉凯基因（上海），技术服务，CRISPR-Cas9模型动物。
d. 中山大学（广州），与劲嘉股份（烟草包装）合作，地中海贫血症基因治疗。
e. 华西医院（成都），Prof卢铀主导的CRISPR基因治疗转移性NSCLC。体外敲除T细胞PD-1基因、细胞扩增后回输患者体内。
CRISPR-Cas9筛选肿瘤药物靶点
技术方法上不能避开Traver Hart15年在Cell上发表的High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities。
1、CRISPR对全基因组范围内进行基因敲除（knock-out）。
2、根据gRNA条件限制，设计了两套敲除文库。“90K Library”：gRNA序列设计较严格的第一套文库共针对17232个基因，91320条gRNA。“TKO Library”：gRNA序列设计较宽松的第二套文库共针对17661个基因，176500条gRNA。
3、6种肿瘤细胞系。GBM细胞系：神经胶质母细胞瘤；RPE1细胞系：视网膜上皮细胞瘤；HCT116细胞系：结肠肉瘤；DLD1细胞系：结肠肉瘤；Hela细胞系：宫颈癌；A375：黑色素瘤。
4、接下来就是简单粗暴的大量病毒转染实验了，重点：劳动力和钱很重要。
5、“The Daisy Model of gene essentiality”：Traver对来源于5种组织6种肿瘤细胞系的基因进行数学归类。Core Fitness Gene，任何细胞缺失该基因功能繁殖、生长受打击，类似扩展版看家基因。Context-dependent Fitness Genes，特定条件下缺失该基因功能会导致细胞死亡、致残。显而易见，6种细胞系种，潜在靶点应该在Context-dependent Fitness Genes中。
6、重点一：Traver找到1580个Core Fitness Gene，GO分析后进行功能归类，不出所料这1580个基因主要功能集中在复制、转录、翻译、修复等类别中。同样不出所料，细胞间信号交流、器官发育、细胞粘附类别的Core Fitness Gene则明显较少。
7、重点二（本文兴奋点）：
a. 临床上一般认为KRAS G13D突变肿瘤对EGFR抑制剂（如erlotinib ）不敏感，但是Traver的实验中发现DLD1（KRAS G13D突变）竟然对EGFR敲除敏感，进一步药物实验显示DLD1对erlotinib特别敏感。而其它5种细胞系，包括HCT116对erlotinib不敏感。这一点提示肿瘤细胞对EGFR活性的依赖可能另有隐情，而部分KRAS突变的患者可能也能从EGFR抑制剂中获益。
b. Core Fitness Gene和Context-dependent Fitness Genes功能对比分析，有助于挖掘发现特定肿瘤特定通路中的Driver Mut。
c. IGF1R为Hela、A375的Context-dependent Fitness Gene，人工抗IGF1R抗体用于阻断IGF激活IGF1R，降低Hela和A375生存能力，对HCT116无影响。
d. HCT116的Context-dependent Fitness Gene则主要集中在线粒体电子传递链复合物I中，HCT116对电子传递链复合物I抑制剂Otenone、Biguanide derivatives phenformin、Metformin 敏感，而其它细胞系不敏感。
e. DLD1的Context-dependent Fitness Gene集中在线粒体核糖体亚基，如预测，DLD1对抗菌药Linezolid , Tigecycline, Chlor- amphenicol敏感，而其它细胞系不敏感或较不敏感。
Hart, Traver et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities
PD-L1调控相关靶点：CMTM6/CMTM4, Ptpn2
2017年7、8月，Nature上发表的两篇CRISPR肿瘤靶点相关的工作：
1、In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target
筛选原理类似Traver的实验思路，体外遗传筛选经免疫治疗的小鼠黑色素瘤B16细胞系中2368个基因，导致NF-κB信号通路功能缺陷的基因缺失往往对PD-1免疫治疗更敏感。而PTPN2基因的缺失则会增强NF-κB信号通路抗原呈递、生长抑制功能，显著增强肿瘤对PD-1免疫治疗的敏感性。
2、Identification of CMTM6 and CMTM4 as PD-L1 protein regulators
同月Nature上Burr发表的CMTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity采用的是全基因组筛选方案，结论与Riccardo得到的结论一致。
Riccardo（The Netherlands Cancer Institute）好玩的地方在于，首先用单倍体遗传筛查方法鉴定出CMTM6基因表达与PD-L1表达相关，再在CMTM6缺陷细胞中单倍体遗传修饰筛查、互补实验鉴定出CMTM4类似相关性。功能鉴定CMTM6大抵是通过去泛素化增强PD-L1蛋白水平，在翻译层面不影响PD-L1表达。总的来说，还是一篇传统的基因功能鉴定实验。
AI大数据筛选药物靶点
初创公司公司不多，主要还是新兴初创公司，公司业务思路比较一致，基本还是以药物结构预测为主，贩卖化合物结构，协助药厂开发新药。
个人以为，这类业务主要还是以加快药物研发速度为主，毕竟开源实验数据越多，新靶点发现的速度也越快，临床转化速度是明显增强先发优势的节点。
不可避免的数据来源限制：基因组数据，基因功能库，新靶点实验数据。
虽然AI用于药物靶点筛选听起来很炫酷，但是个人以为大药厂和研究所的后发优势还是不可忽略，毕竟临床、实验数据还是在大东家手中，大数据和轻人工智能可能也只是换了个说法。
多和一些新兴特色的小医药研发公司进行协作，也许还能多碰出一些不一样的火花，获得时间上的优势。
1、Atomwise
与美国默克合作。感觉更像一个做蛋白结构的公司，猜测默克负责提供化合物，Atomwise负责发现适应症；或者反过来Atomwise根据适应症预测药物结构，默克依然负责提供化合物。
atomwise.com
2、Numerate
numerate.com
3、twoXAR
twoxar.com
4、Cloud Pharmaceuticals
cloudpharmaceuticals.com
5、Insilico Medicine
insilicomedicine.com
Reference
[1] Hart, Traver et al. High-Resolution CRISPR Screens Reveal Fitness Genes and Genotype-Specific Cancer Liabilities. Cell. Volume 163, Issue 6, 1515 - 1526.
[2] Christof et al. Cornerstones of CRISPR–Cas in drug discovery and therapy. Nature Reviews Drug Discovery. 2017: 16,89–100
[3] Riccardo et al. Identification of CMTM6 and CMTM4 as PD-L1 protein regulators. Nature. 2017.
[4] Burr ML et al. MTM6 maintains the expression of PD-L1 and regulates anti-tumour immunity. Nature. 2017.
[5] Robert et al. In vivo CRISPR screening identifies Ptpn2 as a cancer immunotherapy target. Nature. 2017: 547,413–418.
[6] Junwei Shi et al. Discovery of cancer drug targets by CRISPR-Cas9 screening of protein domains. Nature Biotechnology. 2015: 33, 661–667.
[7] Bert Vogelstein, et al. Cancer Genome Landscapes. Science 29 Mar 2013: Vol. 339, Issue 6127, pp. 1546-1558.
配图仅供娱乐 | 2016年冬 上海外滩
祝，
君安