全长转录组到底长在哪儿
说起最新的测序技术，强大的三代测序技术可以说无人不知，其中受到大家吹捧的全长转录组当然也不负众望，把科研那点儿事儿说的清楚明白，让人不得不服，今天小编就通过一篇精彩的文章和大家看看全长转录组到底“长”在哪儿。
高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench），禾本科、高粱属一年生草本植物，是重要的模式C4植物，也是重要的食物、饲料、纤维和能源来源，具有广泛的适应性，抗旱、耐涝。目前有几个品系的高粱已经完成基因组测序，但是转录组注释信息尚不完善，特别是由于可变剪接和可变聚腺苷酸化形成的转录本还知之甚少。
虽然二代高通量测序大量开展，但是收效较少。于是，研究者基于Pacbio RSII平台，通过全长转录组测序在转录组水平对高粱的抗旱性做了深入分析。
下面我们来全面地看看作者是怎么做的~
实验材料：高粱BTx623品系的幼苗，分成对照组和处理组（培养基中加20%PEG，作为干旱处理）
测序方法：Pacbio RS，构建1-2K，2-6K，两种文库，数据量分别为5cell 和7cell，两种样品共测序28cell 。
1.序列比对
对照和干旱处理组各测序14cell，获得1,838,330 ROI，全长的占48%，其余为非全长的，序列长度20bp-3886bp，平均长度为1042bp。
在测序量不足的情况下，三代测序数据有相对较高的碱基识别错误率（由于成本的限制），研究者开发了一套流程-TATPIS：这套流程是针对Pacbio RSII 测序平台的转录组数据分析的流程，可以进行校正错误、序列与参考基因组比对、鉴定所有的由于3’端APA位点不同和可变剪接事件形成的转录本。
经过TATPIS反复地与参考基因组比对，接近95%的序列比对到了参考基因组（只用3代数据）；LoRDEC 和Proovread用短片段数据（2代数据）先对3代数据校正，再比对到参考基因组，比对率最低可达到77%；混合方式中，先用2代数据校正3代数据，将校正后的数据反复与参考基因组比对，比对效率达到96%。这说明不使用2代数据也可以使3代数据的比对效率达到很高的水平。（3代数据准确性低的问题再也不用担心啦~）并且，本次研究中一共有14550个基因的转录本被检测到。
图1 通过多种数据纠错的方法比较最终的比对效率
2.可变剪接及其形成的转录本分析
前人报道高粱中大约1500个基因的pre-mRNA 会经历可变剪接（AS）。本研究中发现这个数目很庞大，一共有10,053个可变剪接事件，只有2950个被报道过。这表明已发表的高粱基因组中有很多AS事件未被注释。
图2 （a）3代测序检测到的可变剪接与已有注释信息比较;
(b) 基因可形成不同转录本个数统计
更令人惊喜的是下面这个例子：一个已知的基因以前被认为只产生一种转录本，但该研究发现这个基因可形成14种可变剪接转录本，也就是另外发现了13种新的转录本，如下图所示：
图3 一个基因通过可变剪接形成14种不同的转录本
为了验证3代测序中检测到的转录本的准确性，作者随机选取6个基因（这些基因在参考基因组中只有一种转录本，但是3代测序检测到2个及以上转录本），设计引物在对照和干旱处理组高粱中进行RT-PCR验证。并且对PCR片段切胶回收构建载体进行测序，结果表明所有的转录本都是真实存在的。同时发现，有些转录本会特异表达（表达或不表达，表达量高低不同），例如: 下图中sb04g021010在对照中表达，干旱处理后不再表达（蓝色箭头指向）；sb040066450的两种转录本在不同环境下表达量不同（蓝色和黑色箭头指向）。
图4 鉴定到的可变剪接形成的转录本的PCR验证（对照，T:干旱处理；）
3.可变聚腺苷酸化（APA）
大多数的mRNA 3’端聚腺苷酸化（APA）是真核生物转录本一种重要的共转录修饰，来源于同一基因由于APA导致包含不同的3’端，从而形成不同的转录本，增强了转录组的多样性。
在该研究中发现：14550个表达的基因中11013个基因有至少一个支持的polyA位点，其中，有20.9%的（2301）基因的A位点可以比对到起始和终止密码子。分析发现7700个基因形成的转录本包含2个及以上聚腺苷酸化位点（如下图a所示），其中，3%的位点在编码区的3’UTR。为了检测编码基因剪接位点下游的A延伸是出现在基因编码区且没有A富集的基因区剪接位点下游，可以表明这不是因为oligod(T)引起的。（图b）展示了一个基因的多个转录本在3’UTR具有多种多聚腺苷酸化位点；（图c）对polyA尾做PCR验证；随机选择几个基因做3’RACE获得3’端完整的cDNA扩增验证APA事件。比如sb04g028450中红色、黑色、蓝色箭头指出的APA事件形成的转录本是与干旱处理相关的。
图5 可变聚腺苷酸化分析
4.不同基因的表达分析
尽管在表达定量分析方面，与二代测序数据量相比，三代数据量有些不足，本文还是使用3代测序的数据粗略的进行了基因表达量分析，发现186个差异表达的基因，并随机选择10个基因进行了RT-PCR验证。
5.基因及非编码分析
与参考基因组比对发现2171个是基因组中没有注释的，对这些基因通过tblastx 和blastx进行分析，总共发现971个新转录本。在全部数据中有不足1%的reads比对到非编码序列，发现149个有注释的miRNA，20个新miRNA；另外发现540个lncRNA。
首创性地开发了TATPI流程分析三代转录组数据，特别在数据校正比对方面，对数据质量提升显著（只可用于有参）；
由于可变剪接形成的新转录本，随机选取进行验证，用PCR及一代测序验证结果一致，并且揭示，同一基因的不同转录本在不同环境下表达模式不同；充分表明可变剪接研究的必要性；
聚腺苷酸化（APA）分析，发现了一个基因可能发生的APA事件并进行了PCR验证，同时，细致的分析A可变剪接位点的特征；
分析内容包括编码RNA和非编码RNA，从基因序列结构分析到基因表达量分析均有涵盖，内容丰富、新颖；
只利用三代数据做了全面的分析，生物信息分析也是亮点。
百迈客生物科技有限公司拥有Pacbio RSII 测序平台，实验平台和信息分析平台成熟稳定，利用此平台已完成多个物种基因组Denovo、全长转录组测序，欢迎前来咨询，期待与您合作。
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