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“浅尝”全转录组研究套路！
最近越来越多的科研君紧跟“步伐”，“玩转”起了全转录组（全转录组即包含mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA的测序）。全转录组之所以这么火的原因就在于大家逐渐意识到单一的mRNA或ncRNA研究已无法满足科研需求，需要结合多种RNA信息进行整合分析，探索潜在的调控网络机制。而全转录组测序无疑成为阐释生物学问题的利器！
但是目前存在的一个问题可能很多老师对全转录数据如何进行深度挖掘还是很清楚，那今天小编就带您通过一篇文章来体验一下全转录组的研究套路吧！
哺乳动物雄性种系干细胞也称为精原干细胞（SSC），可以体外培养SSCs的系统。雌性种系干细胞（FGSCs）可以使用小鼠血浆同系物（MVH）为基础进行纯化和分离。长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是一类转录本长度>200nt的功能分子，能够在转录及转录后水平上调节蛋白编码基因的表达, 从而广泛地参与包括细胞分化、个体发育在内的重要生命过程。环状RNA（circRNA）是一类特殊的非编码RNA分子，circRNA分子呈封闭环状结构，研究表明，circRNA分子富含miRNA结合位点，进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用。
中文名：系统鉴定和解析小鼠胚胎干细胞中lncRNAs 和 circRNAs共表达模式及ceRNA网络
英文名：Systematic identification and comparison of expressed profiles of lncRNAs and circRNAs with associated co-expression and ceRNA networks in mouse germline stem cells.
杂 志：Oncotarget, 2017.
影响因子：IF=5.168
1.实验材料：
小鼠雄性精原干细胞（SSC）和雌性卵母干细胞（FGSCs），每种样本3个生物学重复
2.测序平台
Illumina Hiseq 2000 platform，6个样本
3.技术路线：
图1 技术路线
1、lncRNAs鉴定
将数据与lncRNA数据库进行比对，筛选已知lncRNA。lncRNA数据库包括RefSeq（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq /），Ensem（http://asia.ensembl.org/index.html），或 Noncode v3.0（http://www.noncode.org/index.php）。采用CPC和CNCI软件，鉴定了18573新的lncRNAs和5803已知lncRNA。随机选择新预测的lncRNA使用RT-PCR进行验证。如图2C所示，新的lncRNA转录物全部被扩增出预期大小，证明其真实存在。qRT-PCR结果表明所选择的lncRNA的表达模式在两组细胞系中的表达量与测序得到的FPKM值相符（图2D）
图2.A.已知lncRNA和新预测的lncRNA数目统计图；B.lncRNA长度分布图；C.RT-PCR验证结果图；D.qRT-PCR结果图
2、新预测的lncRNAs在染色体的位置和分类以及表达谱
统计发现lncRNA和mRNA转录物分布在所有小鼠染色体上（图3.A）。另外，根据其在染色体上的位置，可以对lncRNA进行分类：sense overlap lncRNA, bidirectional lncRNA, antisense lncRNA和intergenic lncRNA（图4.B） 。在本研究中发现新预测的lncRNAs主要位于基因间区。同时每种类型的lncRNA的数量，在SSC和FGSC之间的数目是相似的。
图3.A.mRNA和lncRNA在染色体上分布图；B.lncRNA分类统计图
3、小鼠SSCs和FGSC的lncRNA表达谱和GDNF信号机制
表达量热图表明某些基因在SSC和FGSCs中的mRNA和lncRNA水平具有相似的表达模式（图4A，4B）。同时，在雄性和雌性种系干细胞中有8115 mRNA和3996个lncRNA（包括3695个新预测的lncRNA）表现性别特异性表达（p值<0.05）（图5A，5B）
另外，功能分析显示高度共表达的mRNA和lncRNAs的 GO功能富集与细胞周期、细胞增殖和细胞分裂有关，意味着SSCs和FGSCs具有类似的生殖干细胞维持机制，符合以前研究的结果。GDNF（胶质细胞源性神经营养因子）可以通过by PI3K-Akt, Ras/ERK1/2 和SFK 途径实现自我修复。在SSCs和FGSCs高度共表达的mRNA和lncRNAs显著性富集于PI3K-Akt通路，说明SSCs和FGSCs具有类似的GDNF信号传导机制。
图4.A/B.lncRNAs/mRNA表达量热图
图5.A/B性别特异性表达的lncRNAs/mRNA表达量热图
4、性别特异性表达的lncRNA-靶基因功能分析
对性别特异性表达的lncRNA-靶基因进行GO和KEGG分析。在GO分析中（图6A），lncRNA的预测功能主要是与行为，生物粘附，生物钟和生物调节有关。性别偏向表达的mRNA和lncRNA在GO功能主要涉及在遗传印记及其相关调控。KEGG通路分析表明总共有3996个性别特异性的表达的lncRNA 注释到204个KEGG途径（图6B）。这些KEGG通路主要涉及糖代谢，蛋白质代谢和脂质代谢途径，说明其在细胞分化过程中的重要位置，以及lncRNA可能通过这些信号通路。同时显著性富集的还有跟激素相关的代谢途径，特别是性激素在SSCs和FGSCs之间是完全不同的。
图6.A.前10个GO功能注释结果图；B前10个KEGG途径结果图
5、性别偏向表达的lncRNAs和mRNA共表达分析和功能预测
选择10个在SSCs和FGSCs中显著性偏向表达的lncRNA和mRNA进行基因共表达网络（CNC网络）。这些mRNA涉及数个生物过程，包括生殖、干细胞分化、生殖过程、性别分化、遗传印记和性染色质形成等生物学过程。共表达网络显示上调的lncRNAGm11851与遗传印记相关的基因Eed、Ndn和Peg3呈负相关，而下调lncRNA Gm12840与之呈正相关。上调的lncRNA 4930405O22Rik是与遗传印记的调控相关的基因Zfp42，Dppa3和Rnf2呈正相关，下调的lncRNA Atp10d与之呈负相关。
图7.lncRNAs和mRNA共表达网络图
6、circRNA的鉴定和功能分析
采用CIRI软件共鉴定到18822个circRNA，大部分的鉴定的circRNA是外显子circRNA，只有345个circRNA是来源于内含子。我们发现9812（52.13％）circRNAs来源于线性RNA的正义链和9010（47.87％）circRNA来自于线性RNA的反义链。有研究表明，大多数circRNAs的形成都是由位于线性RNA的中间外显子剪切形成，在本研究中获得了类似的结果（图8A）。随机挑选几个cirRNA，通过RT-PCR验证了它们的真实存在（图8B）。作者进一步比较了circRNA来源基因的表达量与其他未能剪切形成circRNA的线性RNA的表达量，结果表明前者的表达量要显著高于后者（图8C）。对circRNAs来源基因进行GO和KEGG分析发现，这些基因主要参与干细胞的自我更新和分化过程。circRNA表达谱显示921个circRNA表现出性别特异性的表达（图8D）。对这921个性别特异性表达的circRNAs来源基因分开进行GO和KEGG分析发现这些基因参与生殖细胞的分化过程。选择前10个GO功能以及KEGG途径进行作图（图8E和图8F），前10个GO功能注释包括调节细胞分化，信号转导和长链脂肪酸生物合成等，前10个KEGG途径包括PPAR信号通路、胰岛素信号通路、VEGF信号通路、GnRH信号通路等。
图8.A.circRNA成环位点分布图；B.RT-PCR验证结果；C.表达量箱线图；D.性别特异性表达的circRNA表达量热图；E.前10个GO功能注释结果图；F前10个KEGG途径结果图
7、ceRNA网络构建
通过mRNA、lncRNAs、circRNAs和miRNA s（数据库数据）的表达模式及调控关系构建ceRNA网络。miRNA结合位点预测通过 miRcode数据库 (http://www.mircode.org/)，同时miRNA–mRNA 靶标关系通过 TargetScan (http://www.targetscan.org/)预测得到。性别特异表达的60个lncRNA和29个circRNA，可以竞争性地结合相同的MRE（miRNA反应元件）。例如，lncRNA Meg3和cirRNA Igf1r可以竞争性地结合miRNA miR-15a-5p，而该miRNAd靶向作用于Inha，Acsl3，Kif21b和Igfbp2 基因。这些特异性表达的lncRNA和circRNA涉及许多生物过程，包括繁殖，调节干细胞分化，生殖过程，遗传印记调控，遗传印记，细胞分化，性别分化，性染色质形成等。
图9.ceRNA网络
小结
这篇文章的思路很清晰，大家可以借鉴一下：
1.lncRNA分析：对鉴定到的lncRNA进行常规信息的整理（包括数目、分布区域、分类、表达量等）➜ 重点对性别特异性表达的lncRNA进行GO和KEGG分析 ➜ 性别偏向表达的lncRNAs和mRNA共表达分析和功能预测；
2.circRNA分析：与lncRNA分析分析步骤基本一致；
3.构建ceRNA网络，找寻mRNA，small RNA，lncRNA，circRNA调控关系。