号外！号外！百迈客重测序遗传图谱再添力作！

近期，《DNA Research》在线发表了由百迈客和浙江大学杨景华教授课题组协作完成的甜瓜重测序遗传图谱文章，该文章利用高密度遗传图谱，成功定位到了控制甜瓜抗蔓枯病的候选基因，并对该基因的功能进行了初步验证，这也是百迈客继去年9月份水稻重测序遗传图谱论文发表在PNAS（http://www.pnas.org/content/113/41/E6026.long）后的又一力作！图谱君拿到文章后就迫不及待地仔细拜读，下面就和大家来共同分享一下这篇文章，希望能给大家在科学研究中带来一些思路和启发。

文章题目：A re-sequencing-based ultra-dense genetic map reveals a gummy stem blight resistance-associated gene in Cucumis melo

中文名：利用重测序高密度遗传图谱定位甜瓜抗蔓枯病基因

期刊：DNA Research

影响因子：5.404

发表日期：2017.09

研究背景

蔓枯病是葫芦科中的一种由子囊菌引起的破坏性病害，因其对葫芦科物种的农艺性状有极大影响，所以几十年前就开始了对抗性种质资源的遗传筛选。甜瓜抗蔓枯病的研究可以减少甜瓜的经济损失，尤其是在热带和亚热带地区。在甜瓜抗蔓枯病的遗传研究中，已经鉴定出多个抗性位点，并且已有紧密连锁的分子标记用于分子辅助育种，但尚未有功能抗性基因的报道。本研究利用全基因组重测序技术构建了一张甜瓜的高密度遗传图谱，利用该图谱对甜瓜基因组组装效果进行优化和提升，同时定位到了一个抗蔓枯病的基因，为甜瓜的抗病研究提供的了理论基础。

材料方法

1、选材

亲本：Cucumis melo spp. conomon (HS)（蔓枯病抗性品种）和Cucumis melo spp. melo (XH)（蔓枯病敏感品种）

子代群体：由HS和XH构建的F1、F2和BC1子代群体，其中F1、F2和BC1用来判断抗病基因的遗传方式，F2群体用来构建高密度遗传图谱。

2、接菌

取3-4星期大的幼苗进行接菌处理，接种D. bryoniae。

3、建库测序

亲本和子代使用HiSeq2500进行PE125测序。

4、图谱构建

利用滑窗法画bin，最终用bin分型和图谱构建。

结果

1、表型鉴定

通过对F1的表型观察发现，抗病性是由显性基因控制（图1），在F2群体中，抗、感病个体的分离比为3:1，在BC1群体中，抗、感病个体的分离比为1:1，这表明该性状是由单个基因控制（表1）。

图1 亲本及F1子代抗病性表现

表1 亲本及子代材料抗病性统计

Crosses	Generation	Resistant	Susceptible	Expected ratio (R:S)	Chi-square	P
HS	P1	20	0
XH	P2	0	20
XH×HS	F1	23	0
XH×HS	F2	165	54	3:01	0.013	0.91
HS×XH	F2	81	32	3:01	0.663	0.42
(XH×HS)×XH	BC1	47	73	1:01	5.663	0.017

2、图谱构建

亲本XH和HS的测序深度为26×，F2群体的子代平均测序深度为2×，Q30大于85%，共获得1,188,159个SNP；利用滑窗法将共分离SNP化为bin，共得到12,932个bin，利用这些bin构建了甜瓜的12个连锁群，图谱总图距为1,818 cM，平均图谱仅为0.17cM（表2）。

表2 遗传图谱统计

Pseudo- chromosome	Total maker	Total distance(cM)	Average distance(cM)	Max gap (cM)
Chr1	969	167.29	0.17	2.402
Chr2	1,041	148.75	0.14	3.74
Chr3	1,597	179.22	0.11	8.07
Chr4	1,073	226.08	0.21	12.461
Chr5	632	79.69	0.13	7.933
Chr6	1,031	164.23	0.16	4.209
Chr7	1,408	170.29	0.12	2.736
Chr8	1,469	122.15	0.08	3.138
Chr9	950	153.95	0.16	2.402
Chr10	170	79.69	0.47	20.059
Chr11	1,562	169.69	0.11	3.807
Chr12	1,030	157.15	0.15	3.071
Total/average	12,932	1818.18	0.17	20.059

通过与之前发表的SNP遗传图谱（PS×SC）和International Cucurbit Genomics Initiative构建的遗传图谱进行比较发现，本研究的结果与他们的结果在各连锁群上存在共线性关系（图2）。

图2 图谱间共线性比较

3、基因组重新挂载

甜瓜参考基因组组装效果不佳，目前仍为scaffold水平，很多基于染色体水平的分析不能够进行。本研究中，利用重测序遗传图谱对scaffold进行了染色体挂载，其中92%的scaffold被锚定在12条连锁群上，这些scaffold的总长度为344.9Mb，其中97.75%的scaffold的方向得以确定，另外有部分scaffold可以比对到多个连锁群上。这些结果说明，该高密度遗传图谱对已发表的甜瓜基因组的组装水平有显著的提升作用。

图3 高密度遗传图谱对甜瓜基因组Scaffold进行重新锚定

4、重组热点分析

在形成配子时，基因组某些区段易发生重组，表现出来的特点是标记在较短的物理区间内，出现了较大的图距，这些染色体区段称为重组热点区（RHs）。在本研究的12个连锁群中，共检测到1135个RHs，并且发现在染色体端粒处有较多的重组，而在中心体周围区域却鲜有重组事件发生（图4）。

图4 重组位点在12个连锁群上的分布

5、与葫芦科物种遗传图谱比较

比较基因组学是揭示物种进化的一种常见方法，通过比较不同物种间序列的共线性关系，可以判断某些物种染色体的结构组成和遗传进化关系。利用该遗传图谱标记与黄瓜和西瓜的基因组进行共线性分析发现他们之间共线性关系较弱（图5），每个连锁群的斯皮尔曼等级次序的相关系数分别在0.07-0.63和0.01-0.67之间。

图5 甜瓜与黄瓜和西瓜基因组共线性分析

6、蔓枯病抗性基因定位

功能基因定位是遗传图谱的一个主要用途，本研究利用遗传图谱将甜瓜抗蔓枯病基因定位在了1个0.667-cM的区间，通过与scaffold比较，在定位区间共发现8个基因（图6），并对这些基因进行多个数据库的注释，以辅助对基因功能的研究。

图6 抗蔓枯病基因定位

利用qRT-PCR分析这些基因在接菌双亲中的表达情况，发现只有1个基因MELO03C012987在亲本中上调表达；同时比较了双亲在定位区间内的差异，发现在MELO03C012987上存在1个非同义突变SNP，使该基因编码蛋白中1个赖氨酸突变为谷氨酸；对部分抗病和感病甜瓜品种的MELO03C012987基因测序分型，发现在上述SNP位置上，感病材料均为腺嘌呤（A），与感病亲本一致，而在6个抗病材料中，5个位鸟嘌呤（G），另外1个材料腺嘌呤/鸟嘌呤（A/G）杂合状态（图7），这与抗病亲本和抗病F1的分型一致，这说明该基因可能就是抗蔓枯病基因。

图7 MELO03C012987基因序列在不同抗、感病材料中的分布

文章到此就结束，图谱君还有意犹未尽之感，因为没有能够把基因功能验证试验的部分添加进去还是有些许遗憾，不过，这不能掩盖这是一篇优秀的遗传图谱文章，功能基因定位、辅助基因组组装、比较基因组研究、标记辅助育种是遗传图谱的主要应用，本研究构建了甜瓜的超高密度遗传图谱，定位到了一个抗病性候选基因，重新对甜瓜基因组scaffold进行染色体水平挂载，比较了甜瓜、黄瓜、西瓜之间基因组间的贡献关系，同时还进行了重组热点分析，将图谱的功能进行了最大化利用，该文章无疑不是我们进行遗传图文章写作的典范！

参考文献

Hu Z, Deng G, Mou H, et al. A re-sequencing-based ultra-dense genetic map reveals a gummy stem blight resistance-associated gene in Cucumis melo[J]. DNA Research, 2017.