云平台助力解析单侧眼组织缺损和视网膜裂症的家族遗传原因
近期云平台助力温州医科大学金子兵教授课题组在Scientific Reports发表了一篇关于眼组织缺损致病性突变的研究，通过对OC患者及其家族成员进行了全外显子组测序（WES）、纯合子定位分析、全面变异分析，找到了血缘家族中单侧眼组织缺损与视网膜裂症的遗传原因，阐述了OC基因型表型相关性。跟随小编去看看吧。
杂志： Scientific Reports
影响因子：4.259
PMID:28831107
01
研究背景
眼组织缺损（OC）是一种常见的发育结构性缺陷，因视神经不完全闭合发展而成。通常在虹膜、脉络膜视网膜或视盘组织部分发生眼组织缺损。这一疾病进程由多种基因突变引起，具有遗传异质性和复杂性。理解OC发病分子机制及基因型与表型相关性，对于OC的分子诊断具有重要意义。
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材料和方法
材料：采集患者及其家族成员血液，提取DNA
测序平台：Illumina HiSeq 2000
分析平台：BMKCloud，具体分析如下：
1.全基因组测序结果与人参考基因组进行比对（SOAPaligner），筛选SNV和Indel（SOAPaligner、GATK ）
2.SNP阵列分析纯合子定位
3.变异型分析
根据ExAC、NHLBI ESP、1000 Genome、dbSNP137数据库检索，对致病变异型进行初始筛选，并进行Sanger测序验证，评估候选变异型作用。分析错义突变体（SIFT、Polyphen-2、MutationTaster），预测每个候选变异型多肽的拓扑模型（SMART、RaptorX、PyMol）后进行序列比对（Clustal Omega），并确定核苷酸保守性程度（PhyloP）。
03
研究结果
1.表型检测
患者是一名14岁男性，携带常染色体隐性遗传病，生于近缘家族，全面眼科检查显示其最近左眼视力逐渐丧失，双眼出现轻微白内障症状。眼前段裂隙灯检查显示右眼正常（图1A），但左眼6点钟方向虹膜缺损（图1D）。眼底检查右眼视神经盘缺损（图1B），左眼脉络膜缺损（图1E）。在视觉范围上，右眼生理盲区扩大（图1C），双眼视觉对比敏感度低（图1C，F）。其他家庭成员没有OC或眼部畸形。除OC表型外，眼底荧光血管造影（FFA）和光学相干断层扫描（OCT）结果提示患双侧视网膜血管炎和继发性视网膜劈裂症（图1G，H，K和L）。接受2个月激素治疗后，双眼黄斑水肿逐渐消失（图1I和J）。
图1 RAX基因突变患者临床特征
2.WES及纯合子定位分析表明RAX发生了突变
WES平均测序深度30X,平均覆盖率＞95%。变异型分析的详细过程（图2A）。变体数据库中排除次要等位基因频率（MAF）>0.005的变异型，纯合子分析显示有12个大于2 Mb的纯合子位点（图2B）。在使用逐步筛选策略后，发现在纯合子区域有3个候选变异型（RAX、TRPM5、PCDH17）。在家族成员中扩大检测后筛选得到一个RAX错义突变（c.113 T> C，p.I38T），且在dbSNP137、1000 Genome、ESP6500、内部数据库、ExAC数据库中没有此错义突变（图3A-B）。
纯合子分析表明RAX基因位于18号染色体上较大的纯合子区域（18.19 Mb）（图2B）。 c.113 T> C变异使疏水性异亮氨酸转变为亲水性苏氨酸。该家族中基因型与表型分离（图3A，B）：患者父母是杂合子携带者，其健康的姐妹无此突变。在38位的异亮氨酸高度保守（图3C），核苷酸位点c.113T> C的PhyloP得分为2.986。表明RAX基因的纯合子突变 c.113 T> C是OC的病因。
图2 变异分析流程及纯合子分析图谱
图3 RAX突变鉴定（A.谱系遗传;B.Sanger验证;C.RAX基因 Ile38 氨基酸残基进化保守性）
3.RAX突变比较分析和结构分析
患者在RAX基因的两个等位基因的exon1内有突变（图4A）。RAX c.113 T > C突变导致38位的氨基酸错义突变，氨基酸I38位于八肽模体中，生信分析预测显示I38T错义突变具有破坏性（SIFT得分：0; MutationTaster得分：1），可能对蛋白质，视网膜和前神经折叠同源序列造成损害（PolyPhen2得分：0.873）。子域识别结果表明这个突变不在同源序列、配对序列中（SMART）。对RAX进行潜在功能分析（RaptorX，PyMol），构建结构模型（图4B），结合遗传分析及结构分析结果，我们推测序列改变增加了I38残基的螺旋构象，从而使RAX蛋白空间结构改变。
图4 RAX基因突变结构分析
04
结果
在本研究中，我们对UC和视网膜裂症患者及其家庭成员进行了分子遗传学检测。利用全外显子组测序和纯合性定位组合方法，筛选后得到唯一候选致病基因RAX致病突变（c.113 T> C，p.I38T）。结果得到临床、功能模型数据的支持。本研究扩大了对RAX突变表型变异性的理解，有利于进一步理解OC发病分子机制及基因型表型相关性。
本研究不仅证明了WES和纯合子绘图是解析遗传异质性疾病患者致病性突变的有用工具，也有助于进一步阐明OC疾病发病分子机制及基因型表型相关性。
参考文献：
Huang X F, Huang Z Q, Lin D, et al. Unraveling the genetic cause of a consanguineous family with unilateral coloboma and retinoschisis: expanding the phenotypic variability of RAX mutations.[J]. Sci Rep, 2017, 7(1).
云平台 杨晓潼丨文案
吴戈宇 | 审核
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