GWAS新玩法-番茄mGWAS那些事
天将降秘笈于斯人也，必先苦读文献，领略精髓，解其套路，为大家所用。
今天小编就给大家讲讲番茄mGWAS那些事～
番茄属于茄科番茄属代表植物，起源于南美洲安第斯山地带，在墨西哥较早驯化栽培，随后被引入欧洲，17或18世纪开始被作为食物，又被重新引入美洲，因此栽培番茄经历了一系列连续的瓶颈期，植物中对驯化事件研究最多的物种之一是番茄，番茄野生种和驯化种间高度的表型多样性使其成为研究人工选择和自然选择的最佳物种。由最初的小果野生番茄到樱桃番茄再到大果栽培番茄，果实大小和果皮颜色等性状受到了强烈的人工选择，对控制相关农艺性状的基因进行QTL定位有助于培育出高产量、高品质的番茄新种质资源。GWAS作为性状相关基因定位的强有力工具，已经广泛应用于众多物种的功能基因挖掘中，在番茄农艺性状定位中，也发挥着举足轻重的作用。
番茄mGWAS研究那些事
如今市面上的番茄种类繁多，但是风味却大不如前，怎样才能尝到从前的味道？集鲜香甜于一体的番茄呢？本研究对种植在弗罗里达州的番茄风味进行研究，为番茄风味的遗传改良提供参考。
材料与方法
1）实验材料：398份番茄自然群体材料种植在弗罗里达州，包括15份S. pimpinellifolium，83份S. lycopersicum var. cerasiforme和300份S. lycopersicum；235份F2遗传群体材料来源TS-532 (S. lycopersicum var. cerasiforme)和TS-640 (S.lycopersicum)杂交。
2）测序策略：245份番茄自然群体材料重测序数据来源于数据库，231份番茄自然群体材料采用重测序，平均测序深度8.5X，235份F2遗传群体材料采用RAD-Seq。
3）表型鉴定：每一份番茄种质3个重复，每株至少取2个果实，至少6个果实混样作为一个生物学重复，代谢物含量通过GC/MS进行测定。
结果与分析
1）挑选代表101个不同番茄品种的160个样本，对整体喜好和风味强度进行评分，利用GC-MS靶向检测挥发性物质和糖类、有机酸等物质，进行代谢物与整体喜好、风味强度的关联分析，发现33个代谢物与消费者整体喜好相关、37个代谢物与风味强度相关，其中28个代谢物与整体喜好和风味强度都相关。
2）为了鉴定参与调控合成番茄果实中风味物质的基因，对种植在佛罗里达的398份番茄开展mGWAS研究。包括：27种挥发性物质、可溶物、葡萄糖、果糖、柠檬酸和苹果酸，共计32种物质。通过重测序共得到2,014,488个SNP位点（P<1.24x10-7），得到251个与20种代谢物表型（包括15种挥发性物质和4种非挥发性物质）显著关联的信号。
3）通过mGWAS在9号染色体和11号染色体上关联到两个与葡萄糖和果糖相关的位点（Lin5和SSC11.1），这两个位点位于报道过的番茄驯化、改良候选区域，大多数的现代番茄品种在这两个位点上都是参考基因型（RR），拥有该基因型的果实含糖量远低于其他基因型材料。为了进一步验证上述的负相关性，对197株F2群体进行mQTL，与含糖量显著相关的4个区域位于2、3、5和9号染色体（LOD＞3），对F2群体进行果实大小与含糖量的关联分析，发现呈显著负相关。9号染色体上Lin5的366位SNP由A突变为G，导致从天冬酰胺突变为天冬氨酸，将该位点不同等位基因型（A/G）进行转基因实验，发现过表达含有突变型等位基因G的果实含糖量显著提高。果实大小和含糖量的负相关性是由于在驯化过程中过渡注重果实大小，从而导致与果实含糖量相关基因的丢失。
4）通过GWAS关联到多个与脱辅基类胡萝卜素（MHO和香叶基丙酮）相关的位点，包括1个MHO相关位点、4个香叶基丙酮相关位点、2个与MHO和香叶基丙酮均相关的位点，对不同等位基因型组合与脱辅基类胡萝卜素含量进行相关性分析，发现在番茄驯化过程中发生等位基因型组合丢失，因此，对脱辅基类胡萝卜素高含量相关等位基因进行选择，提高番茄脱辅基类胡萝卜素含量，可以在不影响果实大小的同时提高果实的甜度，增加番茄的风味。
番茄驯化改良过程中，伴随着果实的增大、番茄碱含量的降低和果皮颜色的改变，本研究通过对442份番茄自然群体进行mGWAS和eGWAS的研究，揭示番茄碱含量的降低和果皮颜色的改变的机制。
材料与方法
1）实验材料：442份番茄自然群体材料种植在两个环境中，包括31份S. pimpinellifolium，124份S. lycopersicum var. cerasiforme和287份S. lycopersicum；235份F2遗传群体材料来源TS-532 (S. lycopersicum var. cerasiforme)和TS-640 (S.lycopersicum)杂交。
2）测序策略：442份番茄材料进行重测序，平均深度6.6X；399份番茄材料进行RNA-seq；442份番茄材料进行代谢组测序；BSA重测序；
3）表型鉴定：每一份番茄种质8个重复，至少取5株材料的果实（每株至少取1个果实），至少5个果实混样作为一个生物学重复，两个地点的代谢物取平均值作为代谢物含量，代谢物含量通过LC/MS进行测定。
结果与分析
1）选取2,678,533个SNPs（p = 9.05×10-8）在442份材料中做mGWAS分析，共获得与514种代谢物相关的3,526个信号（1,291个信号与已注释的163种代谢物相关，2,235个信号与未注释的351种代谢物相关）；对399份材料进行RNA-seq，利用线性模型共检测到434,809个SNPs与3,465个基因显著相关；利用多重检验校正（p = 4.5×10-8）分析转录组和代谢组间的关联，获得820代谢物和9,150个基因；利用mGWAS和eGWAS结果建立(代谢-SNP–基因)网络，包括371个代谢物，970个SNPs，535个基因。
2）构建了2个500份材料的F2群体（PIM×CER，CER×BIG），PIM×CER杂交的F2群体混池中鉴定到果实重量相关的fw1.2，fw3.2位点和116个差异代谢物，CER×BIG杂交的F2群体混池中鉴定出果实重量相关的fw2.2，fw9.1，fw9.3，fw11.1-fw11.2-fw11.3和172个差异代谢物。 番茄驯化过程中（PIM-CER）30％（116/389）的代谢物改变与果实重量有关，改良过程中（CER-BIG）28.0％（172/614）的代谢物改变与果实重量有关。
3）三个果实重量相关的基因fw2.2，fw3.2和fw11.3已被克隆，分别位于SW53、 SW75、 和 SW255区域，共鉴定到与51个代谢物相关的53个信号， SW255区域鉴定到与47个代谢物相关的47个信号。进一步对fw11.3所在的SW255区域进行研究。作者构建了2个NILs渗入系群体，150I是PIM片段渗入到RG背景中（11号染色体上55.17 Mb-55.30 Mb），151I是BIG片段渗入到YP背景中（11号染色体上55.23Mb-55.49 Mb），重叠区域长度为72.8 kb，定位到38个代谢物，与其亲本相比，150I和151I果实重量存在差异，且150I中存在15个差异代谢物，151I中存在16个差异代谢物，其中有8种代谢物是150I和151I共有的。
为了进一步验证是否fw11.3基因影响上述8种代谢物，进一步进行了转基因试验，转基因植株中发现果实重量发生了改变，8种代谢物均为发生变化，发现不是fw11.3基因而是其连锁的周围基因影响了代谢物的含量。
4）番茄驯化过程中番茄碱受到了选择导致其含量降低，代谢组分析发现只有1种SGA是在驯化过程中增加，其余45种SGA均显著下降。通过mGWAS发现7个信号和44种SGA相关，5个信号与驯化区域重合。SW29区域的GAME9突变导致8种SGA含量改变，SW246区域上的基因簇（1个P450氧化还原酶+1个酰基转移酶+8个糖基转移酶）与SGA合成相关，(Solyc10g085230)位点（G/A）突变成终止密码子，导致SGA量降低，该基因活跃表达时期是果实的成熟期，具有转化和降解SGA的功能，而GAME9基因则主要在果实未成熟期表达。大多数与SGA合成相关的基因都在CER-BIG中下调表达，而非在PIM-CER中下调表达，故SGA含量的减少主要是在改良过程。
5）番茄果皮颜色主要与黄酮类物质含量相关，SlMYB12是黄酮类物质合成的关键调控因子。对191个红色BIG材料和44个粉红色BI材料的果皮代谢物进行分析，发现122个差异显著的代谢物，进一步通过代谢-SNP-基因的网络，发现SlMYB12的特征SNP与56个代谢产物和69个基因关联。为了进一步弄清哪些基因受SlMYB12调控，利用两个不同的sgRNAs构建的CRISPR / Cas9载体转化至红色栽培种，获得了四种不同的突变材料，成功获得了粉红色的果实的表型，对4种突变体中获得了869个差异表达基因，相对于野生型，有152个代谢物发生了改变，黄酮类化合物含量的降低与粉红色番茄的果皮一致，表明SlMYB12直接或间接影响黄酮类物质的代谢。
番茄研究迹事
2012年完成番茄全基因组exuberant，组装出番茄品种Solanun lycopersicum基因大小约为900 M。组装指标：(contig N50) 55.7 kb;(scaffold N50)4.45 Mb
研究中选择6个番茄品种（栽培和野生）各取不同组织进行测序和分别组装，其中2个番茄品种（栽培和野生）分别取6个组织部位的转录组测序。发现了51个受到正向选择的基因，阐明了栽培番茄和近缘野生番茄在转录组水平受人工和自然选择的普遍影响。
研究中选择了333份地理来源不同的红色番茄 (S. pimpinellifolium, S. lycopersicum var. cerasiforme 和S. lycopersicum) ＋10份含有抗病基因（R基因）的野生番茄＋17份商业杂交种F1代番茄，利用选择性清除分析（π）+QTL分析+BSA分析揭示番茄从驯化到改良过程（果实由小变大）中受到选择的基因，：通过两步驯化过程中定位位点的研究发现栽培大果番茄比野生番茄大100倍
小编杂谈
代谢物是生物表型最直观的表现，是连接基因组和表型之间的纽带，随着技术的发展，多组学联合分析已经成为趋势，mGWAS将更为普遍的应用，尤其是在研究与风味、口感、次生代谢物等相关的性状。
Cell，Nature，Science，PNAS公认为世界四大名刊，自2012年起至今，通过多组学的论证对番茄的果实大小，重量，含糖量及果实颜色进行了研究，并成功的定位了控制相关性状的基因，多次冲击了世界顶级的自然科学期刊。
参考文献：
（1）Tieman et al，A chemical genetic roadmap to improved tomato flavor. Science 2017.
（2）Zhu et al，Rewiring of the Fruit Metabolome in Tomato Breeding. Cell 2018.
（3）The tomato genome sequence provides insights into fleshy fruit evolution. Nature 2012.
（4）Koenig et al，Comparative transcriptomics reveals patterns of selection in domesticated and wild tomatol. PNAS 2013.
（5）Lin et al，Genomic analyses provide insights into the history of tomato breeding. Nature Genetics 2014.
田韦韦丨文案
张学雯 | 审核
图片来自网络，侵删