笃~笃~笃......，2018年QTL/基因定位12连发~~

假期结束，开始上班了，给自己定了个小目标，一天一篇文献。18年的走起，下着下着，我们合作伙伴们的身影就陆续映入眼帘，一篇，两篇......，哎呀妈呀，这么多!害我数串了。总算下载完了，什么？12篇？是的，12篇QTL定位相关的SCI文章就这样“横空出世”了。

在这里，小编必须要恭贺各位老师们在新年伊始取得了“开门红！

来来来，咱往下看↓

（文末继续有中标的国自然标书分享~）

本期，为大家解读通过SLAF-BSA对小麦抗病性进行基因定位的文章，一起来看一下长江大学马东方副教授和朱永兴讲师在《Scientific Reports》上发表的“利用SLAF-BSA快速鉴定小麦空间辐射突变体中抗条纹病基因”。

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研究背景

普通小麦是主要的粮食作物之一，但由于小麦条锈病菌的侵害，使得小麦产量逐年降低，尤其是在西南和西北地区。条锈病抗性分为全生育期抗性（ASR，包括幼苗和成株）和成株抗性（APR），前者通常是单个主效基因控制的，是倾向于针对某一特定菌种而产生的抗性，而后者的抗性则不针对某一特定菌种且为数量遗传，其保护水平通常是不完全的，并受生长阶段，温度，湿度和接种量的影响。因此，定位这两种小麦抗条锈病抗性基因是当务之急。

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材料与方法

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 材料 

亲本：铭贤169（Mingxian 169）×R39，铭贤169为感病栽培种；R39为抗性品种，是郑麦9023（zhengmai 9023）突变体材料自交8代所形成

群体类型：F2群体

混池规模：45+45

其他材料：F1、BC1和郑麦9023

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 实验处理 

在可温控的温室内，利用7个条锈病菌 (CYR29, CYR30, CYR31, CYR32, CYR33, Su11-4 和 Su11-11)的新鲜夏孢子对双亲、F1、BC1，F2和郑麦9023的完全展开的第一片子叶进行侵染。

幼苗试验处理：先在10°C的培养室内培养24h，然后移置温室，在环境变化的条件下培养（循环方式：18°C下，光照16h；10°C下，黑暗8h）；

成株试验处理；将发芽幼苗在4℃冰箱中春化5周，然后移栽到盆中温室生长。

1个月后，孕穗期的亲本和后代接种混合有滑石的夏孢子（urediniospore）并如上所述温育，接种18-20d记录侵染类型（IT），并按前人划分标准分为0-4。IT 0至2+的认为具有抗性，而IT3至4的则认为是易感的。

收集种子测量千粒重（TSW）。每个栽培品种三个生物学重复。

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 技术手段 

1）SLAF-seq+BSA：铭贤169、R39、感病混池和抗病混池（混池材料各45个），计算方法：SNP-index和ED；

2）SSR-遗传图谱：铭贤169、R39、高感病混池和高抗病混池（混池材料各10个，来自上述测过序的材料）（互为验证）；

3）qRT-PCR：每次实验做了三个生物学重复，每个重复两次技术性重复。

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实验结果

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 小麦突变体R39具有成株抗性 

在抗性鉴定中发现，其在幼苗期对7种病菌均呈现感病，而成株期均呈现抗病（图1a）；而郑麦9023和铭贤169全生育期均为感病。此外，R39的千粒重显著高于郑麦9023和铭贤169，这表明在条锈病发病条件下，R39的籽粒产量更高，种子质量更好（图1b-d）。

图1 抗性和产量评价

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 针对CYR33菌种，R39 的APR由一个隐性基因控制 

如表1，F2群体分离比是3:1，所以CYR33的R39 的APR由一个隐性基因控制。这个抗病基因命名为YrR39。在R39、抗性F2和抗性BC1材料中一个显著特征是叶斑点。而且上述两个特征在未接种的群体内也是一样的。

表1 亲本及分离群体抗病和感病频率统计

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 SLAF-seq+BSA的分析结果 

利用SNP-index和ED两种算法，将抗病基因YrR39定位在4B染色体上17.39 Mb的区域内。（这里就不细说了，直接上图）

图2 BSA分析的两种方法的结果

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 利用SSR标记验证目标区域 

4B染色体上有83对SSR是有多态性的，但是其中只有8对能清楚的区分双亲及两个混池。利用其对462个F2个体进行基因分型并构建遗传图谱，将YrR39定位于染色体4BL 的2.6cM的区间内，其侧翼标记为Xwmc495和Xwmc48（如图3）。这与BSA分析结果一致，也验证了SLAF-seq检测结果的准确性。

图3  染色体4BL的连锁图谱

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 条锈菌感染对候选基因表达的影响 

目标区域包含126个基因（表3），通过功能注释，找到21个与条锈病抗性相关的基因，拟定为候选基因，并进行qRT-PCR验证。结果表明，在病菌接种后12、24、48和96h，只有候选基因Traes_4BS_C868349E1（注释为F-box / LRR-重复蛋白）在R39中显示出比在铭贤169中更高的表达水平（图4）。 这表明其可能参与了R39对条锈病的抗性。

表3 关联区域内结果

图4  21个候选基因的qRT-PCR结果

在讨论中看作者后续工作

1.作者将对这个基因进行其他方面的验证，怎么验证呢，作者虽然没说，但我们也可以推测一下，是不是可以利用KASP验证呢？（验证SNP位点的同时还能相对的缩小区间。）是不是也可以RNA干扰，过表达，转基因或者基因编辑（它最近嘎嘎火）等等，这些验证手段均可进一步对其进行验证。

2.推测R39是一种类病变突变体，并且斑点性状可能是造成成株期阶段条锈病抗性的原因， 目前正在分析点状特征与抗性的关系。（这一点有意思啦）

注：虽然利用SLAF-seq和BSA相结合进行基因定位这个策略在其他物种中已有应用，但作者是第一个利用这个策略在小麦上进行抗病基因定位。

借鉴之处

1. 表型鉴定的方法是基于前人的方法，且将突变的原始材料郑麦9023作为对照，增加结果的可靠性；

2. 利用SSR图谱和测序结果互相验证，确保结果可靠；

3. 找到区间，然后看功能注释找候选基因，对候选基因进行qRT-PCR验证（也可用RNA-seq来验证）

4. 研究斑点性状这个病症与抗性的关系，这一点来源于细心的观察和不断的思考（思考什么呢？你懂得~~）；

5. 作者仍在继续验证这个基因（科研的态度）。正所谓真金不怕火炼，前面所提几种方法均可对其验证，以增加可靠度。

遗传群体事业部  小猴子丨文案

许语辉 | 审核

图片来自网络，侵删

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