番茄中cf -10介导的C. fulvum感染的防御反应机制解析
英文题目：Physiological and RNA-seq analyses provide insights into the response
mechanism of the Cf-10-mediated resistance to Cladosporium fulvum
infection in tomato
中文题目：生理和RNA-seq研究解析番茄中cf -10介导的C. fulvum感染的防御反应机制
发表杂志：Plant Molecular Biology，2018.01
叶霉是由活体营养菌Cladosporium fulvum（C. fulvum）引起的，是影响番茄的最常见疾病之一。番茄与C. fulvum病原体的相互作用遵循典型的gene-for-gene关系。根据这一关系，一个C. fulvum效应基因产生的该基因本身或其调节的宿主靶向基因会被对应的番茄C. fulvum抗性基因的产物所感应，如Avirulence基因。番茄的Cf系列基因是一类重要的C. fulvum抗性基因，可与C. fulvum Avr基因相匹配，激活防御基因的表达并触发HR。Cf系列基因包括Cf-2、Cf-4、Cf-5、Cf-9和Cf-10，对于Cf -19和Cf -12以及它们如何介导抗性反应方面的研究较多，但Cf-10介导的抗性反应机制尚不清楚。转录组分析是解析环境适应、发育调控和植物-病原体相互作用中基因表达和调控机制的有力工具。东北农业大学许向阳老师课题组利用抗性和非抗性番茄材料，从生理学层面和转录组层面解析了Cf-10介导的C. fulvum抗性反应机制。
试验材料：Ontario 792（带有Cf-10）、Moneymaker（无C. fulvum抗性基因）两种番茄株系。
试验方法：
1）接种C. fulvum 0、5、9、12、16、21日，显微镜观察，测定酶活性，用LC-MS测定激素水平；
2）接种C. fulvum 0、21日，各3个生物学重复，共12个样本进行转录组测序，测序平台为北京百迈客生物科技有限公司Illumina，PE150；
3）qRT-PCR验证。
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番茄叶中C. fulvum的入侵过程
Ontario 792和Moneymaker叶片中C. fulvum的侵染过程如图1所示。在Ontario 792叶片中，在9 dpi中出现少量的HR区域，在16 dpi 才开始显著扩大，且没有菌丝萌发。在Moneymaker中，菌丝萌发，坏死灶在9 ~ 16 dpi的叶片中持续增加，并覆盖叶片表面。
图1 显微镜观察病原体侵染过程
注：A~E为Ontario 792，F~J为Moneymaker
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抗氧化酶和过氧化物酶对C. fulvum感染的应答反应
接种后0、5、9、12、16和21 dpi，分别对番茄叶片中ROS的含量、CAT、SOD、POD的活性进行检测，如图2所示。从0到21 dpi，Ontario 792中ROS含量始终低于Moneymaker。在两个株系中，从0到5 dpi CAT的活性增加，然后从5到21dpi缓慢降低。在Ontario 792中，从0到5 dpi SOD的活性增加，然后从5到12 dpi下降。相比之下，Moneymaker中，SOD活性刚开始是下降，然后从5到21 dpi呈增加趋势。Ontario 792中，POD活性从0到21 dpi相对稳定，但在Moneymaker中，大幅增加直到9 dpi，然后从9到21 dpi保持相对稳定 。从0到16 dpi，Ontario 792中CAT和POD活性高于Moneymaker。这些结果说明Cf-10激活了番茄对C. fulvum感染的生理应答反应。
图2 C. fulvum侵染后ROS含量和CAT、SOD、POD活性的变化
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激素对C. fulvum感染的应答反应
如图3所示， Ontario 792中，SA含量刚开始缓慢下降，然后缓慢上升直到16 dpi。Moneymaker中，SA含量在5 dpi下降至最低水平，然后逐渐增加直到12 dpi。Ontario 792中，从5 ~ 9 dpi JA含量迅速上升到峰值，然后从9到12dpi下降到原始水平，但Moneymaker中始终保持相对稳定，表明JA可能参与激活对C. fulvum的防御系统。
图3 C. fulvum侵染后SA和JA的变化
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基因与生物途径对C. fulvum感染的应答反应
4.1差异表达基因及其功能与途径分析
为了探讨受C. fulvum感染的和未受感染的Ontario 792、Moneymaker中转录组的差异，进行了转录组测序。Cf-0 vs Cf-16、MM-0 vs Cf-0、MM-0 vs MM-16、MM-16 vs Cf-16分别有2242、329、1823和285个DEGs，表明Ontario 792携带的防御应答基因可能比Moneymaker多。Cf-0 vs Cf-16 和MM-16 vs Cf-16只有76个共有的DEGs，表明Ontario 792、Moneymaker中有不同的基因集的反应机制被C. fulvum激活。
对DEGs 进行GO和KEGG注释及富集分析，GO注释结果表明Cf-0 vs Cf-16的DEGs主要注释在BP分类中的“氧化还原过程”、“光合作用”、“光捕获”等，CC分类中的“细胞壁”、“叶绿体类囊体膜”等，MF类别中的“氧化还原酶活性”、“水解酶活性”等term中。对于MM-16 vs Cf-16的DEGs，只有“氧化还原过程”在CC类别中是显著的，在CC类别中是“叶绿体”、“细胞核”和“线粒体”，在MF类中没有显著的term。因此，这些重要GO term的相关的基因可能在抗C. fulvum感染中具有重要作用。KEGG富集分析结果表明，Cf-0 vs Cf-16的DEGs在植物激素信号转导、苯丙类生物合成、光合作用-天线和植物-病原互作通路中大量富集。在Cf-0 vs Cf-16和Cf-16 vs MM-16中分别有59和8个与植物激素信号转导通路相关的DEGs。Ontario 792和Moneymaker的激素生物合成相关的DEGs表达模式不同，说明植物激素在调节C. fulvum的抗性反应方面起着关键作用。
图4 DEGs功能注释与富集分析
采用MapMan软件对Cf-0 vs Cf-16的DEGs的调控通路进行了分析（图5），其中大部分DEGs上调，且为TFs。上调的基因可分类到信号转导、PR蛋白、TFs、激素ABA、SA、JA和乙烯，进一步证实了番茄中这些途径在cf -10介导的c - fulvum感应和防御中起重要作用。TFs是基因表达的主要调控因子，在病原攻击后的植物防御应答的基因转录重组中发挥重要作用。Cf-0 vs Cf-16中有192个TFs，可分为42个TF家族。其中，一些TFs与非生物或生物胁迫的应激反应有关。
图5 利用MapMan进行DEGs调控通路分析
4.2 DEGs的qRTPCR验证
选择参与植物-病原体相互作用、植物激素信号转导、抗氧化酶依赖性防御信号等重要途径的Cf-0 vs Cf-16、MM-16 vs MM-16共有DEGs，且是TF的基因，进行qRTPCR验证。结果表明，RNA-seq和qRTPCR结果高度相关(R2 = 0.72349)。
总 结
本研究从生理方面，分析两种番茄株系在感染C. fulvum后活性氧(ROS)、保护酶和激素的应答反应，从转录组层面，探究两种番茄株系在感染C. fulvum后基因表达和生物途径的应答反应。结果表明，C. fulvum感染诱导激活POD、CAT和SOD的活性，降低ROS水平，JA在感染初期参与防御应答反应。感染后，表达量发生变化的DEGs大多与防御信号通路相关，包括氧化还原过程、氧化还原酶活性和植物激素信号转导。因此，cf -10主要通过调控与氧化还原、氧化还原酶活性和植物激素信号转导等相关的基因的表达，其中包括一些重要的TFs，调节激素JA、SA信号级联通路、抗氧化酶防御信号系统等，来介导番茄对C. fulvum的防御应答反应。
参考文献
Guan Liu, Junfang Liu, Chunli Zhang, et al. Physiological and RNA-seq analyses provide insights into the responsemechanism of the Cf-10-mediated resistance to Cladosporium fulvum infection in tomato. [J]. Plant Molecular Biology.
转录调控事业部 杨 静丨文案
吴戈宇| 审核
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