转录组和代谢组解析马铃薯色素合成的分子机制
上期小编和大家分享了百迈客成功案例-转录组和代谢组解析风信花色变化分子机制，大家可以发现，其中，代谢组并没有走普通转录组项目的套路（基于测序结果，采用生物信息的手段，挖掘决定表型关键基因），而是采用靶向检测几种代谢物的方法，从代谢组角度进一步验证两种花色风信子花青素合成通路相关的基因。那么，随着代谢组的不断发展，目前经典代谢组分析方法，更多的是倾向于基于代谢物检测结果，通过生物信息分析的手段，深入挖掘与表型相关的关键代谢物，进而辅助转录组挖掘决定表型的关键基因。今天，我们通过一篇经典案例，来一探转录组和代谢组联合分析的套路。
英文题目：Network analysis of the metabolome and transcriptome reveals novel regulation of potato pigmentation
中文题目：转录组和代谢组解析马铃薯色素调控分子机制
发表杂志：Journal of Experimental Botany
影响因子：5.830
研究背景
目前在许多水果、蔬菜和鲜花中，已鉴定花青素种类超过635种。果实的紫色和深红色主要来源飞燕草色素，牵牛花色素和锦葵花色素；而亮红色主要源自矢车菊素和天竺葵素。据报道，已鉴定出部分编码花青素合成和调控的基因，但对于每种花青素生物合成途径的调控机制仍有待进一步研究。
彩色马铃薯因其富含较强抗氧化性的花青素而引起各国学者的广泛关注。本研究利用转录组和代谢组联合分析的方法，探索3种不同色泽马铃薯品种花青苷合成通路的调控网络，为马铃薯花青素的生物合成和调控相关的分子机制提供了新的见解。
材料与方法
样品准备：Hongyoung（淡红色）、Jayoung（深紫色）、Atlantic（白色），在室温散光照射下，诱导马铃薯发芽，收集嫩芽，每个品种6个生物学重复，每个重复由三个单株混合而成，共18个样本。
1.转录组测序：Illumina Hiseq2000。
2.代谢组检测：超高液相和质谱联用（UPLC-Q-TOF-MS）。
3.qRT-PCR：验证花青素生物合成和马铃薯色泽相关的转录调控因子，每个品种3个生物学重复。
技术路线
研究结果
01
不同色泽马铃薯差异代谢物分析
对三种不同色泽马铃薯样本进行主成分分析，结果显示不同品种马铃薯代谢物差异显著。代谢组检测表明，在正离子模式下，共检测出841个信号离子，其中Hongyoung和Atlantic共有559个信号离子，Jayoung 和Atlantic 共有441个信号离子，Jayoung 和Hongyoung 共有 454 个信号离子；在负离子模式下，共检测出895个信号离子，其中Hongyoung 和 Atlantic共有 651 个信号离子，Jayoung 和Atlantic 共有470个信号离子，Jayoung和Hongyoung共有 466 个信号离子。
图2不同颜色马铃薯PCA分析和特征代谢物数目
02
花青素是苯丙素通路中类黄酮合成的花色素苷的酰基糖苷。据报道，花青素衍生物飞燕草色素（Dp），芍药色素（Pn）和锦葵色素（Mv）是紫色和深色的色素来源，而花青色素（Cy）和花葵素（Pg）的衍生物是亮红色果实中的主要色素。结果显示，Hongyoung与Jayoung在苯丙素合成途径下游的黄酮类组分差异显著，表明这些代谢物可能是造成马铃薯品种间色泽差异的关键因素。Hongyoung中芹黄素、山柰酚、二氢山柰酚和天竺葵色素衍生物的含量较高，而Jayoung中芍药花青素、牵牛花色素、飞燕草色素和锦葵色素衍生物积累较多。
图3 黄酮类化合物的二级质谱分析
图4 基于KEGG通路和文献构建的花青素合成通路示意图
03
Hongyoung 、 Jayoung和Hongyoung 和 Jayoung共1044个差异基因；Hongyoung 和 Atlantic 中有 756 个差异基因，其中482 个基因上调，274 个基因下调。Jayoung 和 Atlantic 中有519 个差异基因，其中有248个上调基因，273个下调基因。根据其注释功能将其分为20组（主要BIN），分为未知注释转录本（37.7％），蛋白质活性调控（10.3％），应激（9.6％） ，其他代谢（7.3％），转录调控因子（5.7％），次级代谢（5.3％）和信号传导（4.0％）。
图5 不同马铃薯差异基因韦恩图
表1 不同马铃薯差异基因注释分析
04
对 22 个花青素衍生物和 167 个基因（三个马铃薯品种中类黄酮代谢、植物激素、信号通路、转录因子相关的差异表达基因）相关性分析，发现有 119 个基因与这 22 个花青素衍生物相关性极高（相关系数>0.9）。在 Hongyoung 和 Jayoung 中对相关性高的 119 个基因和22个代谢物做共表达网络分析，把119个基因参与的调控网络聚为5组（ClusterI-V），22 个花青素衍生物参与的代谢通路分为 4 组 (Group A-D) 。
Hongyoung中 Group A 代谢物的含量高于Jayoung，与 Cluster I 和 Cluster II 中的基因有较高的关联性。而在 Jayoung 中 Group D 代谢物的含量较高，与 Cluster IV 和 Cluster V 中的基因有较高的关联性。
图6 基因与花青素相关代谢产物调控网络
表2与花青素相关代谢物相关的调控基因的分类
05
差异表达基因RT-PCR验证
随机挑选 14 个基因进行 RT-RCR 验证，结果表明 Cluster I和Cluster II 中的基因（JAZ8, JAZ10, WRKY75, ERF1 和 MYB9）在 Hongyoung 的表达量较高；ClusterIV中的基因（MYB3和UFGT）在Jayoung中表达水平较高；而 Cluster III 中的基因在 Hongyoung 和 Jayoung 中的表达水平无明显差异。RNA-seq和RT-PCR相关性系数0.89，进一步证明测序结果的准确性。
图7花青素生物合成相关和马铃薯色泽潜在转录调控因子RT-PCR验证
文章亮点
1.本研究对三个不同品种的马铃薯样品同时做转录组和代谢组，首先通过代谢组分析不同马铃薯品种与色泽合成的差异代谢物，然后采用转录组，筛选与色泽合成相关的类黄酮代谢、植物激素、信号通路、转录因子相关的差异基因，最后将色泽合成相关的差异代谢物和差异基因做关联分析，挖掘马铃薯色泽的调控网络。
2. 本研究基于转录组测序和代谢组检测结果，主要通过生物信息分析手段，更高效的挖掘与表型相关的差异基因和代谢物，同时将基因和代谢物变化以精美的图形呈现，为高分文章的发表添砖加瓦。
文章框架思路如下
看了文章框架是不是感觉hin简单啊，转录组标准分析→代谢组标准分析→转录组和代谢组联合分析→RT-PCT验证，即可轻松实现文章发表，哈哈，这就是转录组和代谢组联合分析套路啦，大家赶快试一下吧，绝对超出你的预期哦！
画 外 音~~~
参考文献
Kyoungwon Cho ., Kwang-Soo Cho ., Hwang-Bae Sohn .,et al. Network analysis of the metabolome and transcriptome reveals novel regulation of potato pigmentation. Journal of Experimental Botany. 2016, 67(5), 1519–1533 doi:10.1093/jxb/erv549 .
转录调控事业部 苏静静 | 文案
吴戈宇 | 审核
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