转录组助力揭示调控果实品质形成的新机制
番茄是一种受到广大人们群众喜爱的水果（或蔬菜），且番茄品种繁多，果实形状和颜色多种多样，当然我们食用番茄的方式也是各种招式轮番上映，可生食、煮食、加工番茄酱、番茄汁或整果罐。其实在科研界，番茄也是一个宠儿，关于番茄的研究也是各种各样，今天小编跟大家分享的就是在番茄果实研究方面的新进展，而且很荣幸在这么前沿的工作中客户也选择了我们百迈客进行相关转录组的测序。
中文名: MuMADS1 和 MaOFP1在番茄ovate突变体中调控果实品质的形成
英文名: MuMADS1 and MaOFP1 regulate fruit quality in a tomato ovate mutant
杂志：Plant Biotechonology Journal，2017
影响因子：7.443
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研究背景
果实发育成熟和品质形成一直是番茄、香蕉等水果重点关注的问题之一。研究表明，果实成熟和品质形成是一个受到严密调控的过程，有许多转录因子参与了该调控网络。MADS-box转录因子家族就是其中之一，在番茄的许多研究结果表明MADS-box参与调控果实发育和成熟，但是在香蕉中关于该转录因子功能的研究还没有相关报道。MADS-box一般会通过蛋白互作形成同源或异源复合体来发挥转录调控的功能。
在之前的研究中，作者发现香蕉中OFP1（MaOFP1）参与调控果实成熟过程。以前的文献报道显示，OFP1为一个转录抑制型转录因子，跟其他各种转录因子存在互作；且在许多植物（如拟南芥、水稻、番茄等）中参与了多个生物学过程，包括胚珠发育、维管形成和次生壁发育等。而MaOFP1在果实成熟中的功能是一个新的发现，之前的实验还发现MaOFP1可以和香蕉的一个MADS-box蛋白MuMADS1互作，相互拮抗作用参与调控香蕉采后乙烯催熟过程。香蕉果实成熟过程实际上也包含了果实品质的形成，那么MaOFP1和MuMADS1是否在果实品质形成中也发挥新的调控功能呢？本研究选取了番茄ovate突变体来研究这个问题。
OVATE 编码一个果实伸长的负调控转录因子，该基因的突变导致番茄果实呈梨形。但是，并非所有含 ovate 突变的遗传背景都呈梨形，说明 ovate 可以和其它基因互作导致梨形果实的形成。本研究通过将MuMADS1和 MaOFP1共转化番茄ovate突变体并结合转录组分析，发现MuMADS1和MaOFP1可以恢复ovate突变体果实的形状，且改变果实的硬度、可溶性固形物和糖含量等品质相关性状。转录组数据分析结果表明，这两个转录因子可以通过调控碳水化合物代谢和细胞壁代谢过程中重要酶基因的表达，调控果实的品质，为果实品质调控研究和果型改良提供了重要理论依据。
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材料方法
1、实验材料：野生型、ovate突变体番茄，在ovate突变体背景中三种不同转基因系M（过表达MuMADS1）、O（过表达MaOFP1）、MO（同时过表达MuMADS1和MaOFP1），取红色成熟时期的果实提取RNA，每一种材料取3个生物学重复，共15个样品。
2、测序方法：mRNA seq，百迈客生物科技有限公司Illunima GAII。
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技术路线
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研究结果
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转基因材料的构建和鉴定
在ovate突变体材料中分别构建了三种过表达（35S启动子）材料：M（过表达MuMADS1）、O（过表达MaOFP1）、MO（同时过表达MuMADS1和MaOFP1）。通过qRT-PCR检测MuMADS1和MaOFP1在转基因材料中的表达，两个基因在果实发育成熟不同时期均表达，且表达量逐渐升高，在红色成熟期表达量最高。通过比较发现，两个基因在MO中的表达要高于在M或者O中。
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MuMADS1和MaOFP1调控果实形状和品质
首先观察转基因材料果实形状的表型。野生型番茄果实一般为圆形，ovate突变体为梨形。转基因材料M和O为椭圆形，部分恢复了突变体的表型，但OM的果实为圆形，完全恢复了突变体表型。这说明果实形状很大程度上受到MuMADS1和MaOFP1的调控。
其次，进一步分析果实品质相关的表型，包括果实硬度、可溶性物质、糖和有机酸含量等。分析结果显示，在这些果实品质指标上，OM均能恢复ovate突变体的表型，而M和O只能部分恢复突变体表型。这说明MuMADS1和MaOFP1协同参与调控果实品质的性状。
图1 过表达MuMADS1和MaOFP1调控果实形状和品质
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转录组测序和数据分析
为了进一步挖掘MuMADS1和MaOFP1调控果实品质的分子机制，分别对野生型、ovate突变体、转基因材料（M、O、MO）的红色成熟期果实进行转录组测序，并进行相关数据分析。
（1）差异表达基因（DEGs）数目分析
从不同组合的差异基因数目来看，WT vs. ovate为1395个，WT vs. M（842个），WT vs. O（904个），WT vs. MO（286个）；ovate vs. M（84个），ovate vs. O（342个），ovate vs. MO（530个）。由此可见，野生型与突变体之间的DEGs数目最大，差异最大；随着将两个转录因子在突变体过表达，转基因材料与野生型之间的DEGs数目越来越少，且两个基因同时过表达时DEGs最少；相反转基因材料与突变体之间的DEGs数目越来越多，两个基因同时过表达时最多。这也说明表达MuMADS1和MaOFP1可以调控和恢复ovate突变体的DEGs。
（2）差异基因的功能注释和富集分析
对所有差异基因进行COG、GO、KOG、KEGG等数据库的功能注释分析。为了进一步验证MuMADS1和MaOFP1可恢复突变体的转录组测序数据，以COG数据库的数据结果为例来看。在WT vs. ovate的DEGs在COG中注释有25类，以“碳水化合物的运输和代谢”这个分类来看，在WT vs. ovate的DEGs中排在第五（64个DEGs，7.86%）。在MuMADS1和MaOFP1转化ovate突变体后这个数字下降了，而与突变体相比则趋势相反，逐渐上升。
通过对DEGs的KEGG通路富集分析显示，“淀粉和糖代谢”出现的频率最高，通过分析其在各差异分组DEGs的比例发现，变化趋势与DEGs的功能注释结果相类似。KEGG富集结果中排在第二位的为“碳代谢”，这说明在整合MuMADS1和MaOFP1两个外源基因表达后，“淀粉和糖代谢”和“碳代谢”这两类初生代谢过程在番茄果实品质形成过程中受到了激活。
（3）基因表达分析
根据以上转录组数据分析的结果，接下来筛选各差异分组DEGs中与糖和细胞壁代谢相关的基因进行表达量的上下调分析。在WT vs. Ovate的DEGs中73个上调和13个下调表达，在MuMADS1和MaOFP1转化ovate突变体后这个数字下降了，而与突变体相比则趋势相反，逐渐上升。
因为转化MuMADS1和MaOFP1可以互补ovate突变体表型，那么在DEGs中，WT vs. ovate分别与WT vs. M，WT vs. O，WT vs. MO的交集均不是MuMADS1、MaOFP1和MuMADS1+MaOFP1调控的靶基因。以此为据筛选到可能受到MuMADS1、MaOFP1和MuMADS1+MaOFP1调控的DEGs，其中主要包括碳代谢途径、细胞壁代谢。
图2 MuMADS1、MaOFP1和MuMADS1+MaOFP1调控的DEGs
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转录组数据的实验验证
为了验证转录组数据的结果，选取了DEGs中5个参与糖和细胞壁代谢的基因进行qRT-PCR的表达量验证。实验结果显示，绝大多数DEGs的qRT-PCR结果与转录组测序结果相一致。
点评
本研究是国际上首次报道MuMADS1和 MaOFP1共同调控果实品质的性状，解析了这两个转录因子相互互作并协同调控果实形状及品质的分子机制，更新了MADS-box转录因子参与作用果实品质的调控网络，拓展了香蕉等热带果树遗传改良的思路。
参考文献：
Liu J., Zhang J., et al. (2017). MuMADS1 and MaOFP1 regulate fruit quality in a tomato ovate mutant . Plant Biotechnology Journal doi: 10.1111/pbi.12843
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转录调控事业部 | 文案
吴戈宇 | 审核
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