案例解读 | BMKCloud公共数据整合分析
随着高通量测序技术的发展，测序数据量呈现指数级增长，各类公共数据规模日益庞大，进而整合公共数据分析已逐渐成为很多研究中的一项重要分析手段。整合公共数据分析一方面可以降低研究成本，另一方面可以补充一些受限于研究者研究背景与技术水平而难以自主检测的关键数据。截至目前，高通量测序数据库SRA已收录超过10Pbase的NGS数据，但是由于公共数据整合分析过程中涉及到下载、存储和分析等各个技术门槛，导致研究者对公共数据的利用不充分。百迈客从2015年以来针对此类问题开发了一键式数据下载和存储的云平台，辅以多达25个高度集成分析流程，可视化界面助您轻松搞定数据库的整合分析。近日，中国农业科学院马有志老师课题组的徐兆师研究员等通过百迈客云平台结合公共数据完成拟南芥抗病性研究，该成果于2018年1月22日发表在《Frontiers in Plant Science》。
The Wheat Bax Inhibitor-1 Protein Interacts with an Aquaporin TaPIP1
and Enhances Disease Resistance in Arabidopsis
小麦Bax抑制剂-1蛋白（BI-1）与水通道蛋白TaPIP1相互作用增强拟南芥抗病性
摘 要
Bax抑制剂-1（BI-1）是真核生物中进化保守的内质网（ER），定位细胞死亡抑制因子。 BI-1抑制生物和非生物胁迫的能力在拟南芥中得到了充分研究，而小麦中BI-1的功能在很大程度上是未知的。在这项研究中，将禾谷镰刀菌（Fg）处理的小麦进行RNA-seq分析，然后分离小麦BI-1基因TaBI-1.1。通过水杨酸（SA）处理诱导TaBI-1.1表达，并通过脱落酸（ABA）处理诱导TaBI-1.1的下调。基于β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色，TaBI-1.1在成熟叶和根中表达，但不在下胚轴或幼叶中表达。 TaBI-1.1在拟南芥中的组成型表达增强了其对丁香假单胞菌病毒（Pst）DC3000感染的抗性并诱导SA相关基因表达。此外，TaBI-1.1转基因拟南芥显示出由高浓度SA引起的损害的减轻，并降低了对ABA的敏感性。与表型一致，35S :: TaBI-1.1和Col-0植物的RNA-seq分析显示TaBI-1.1参与生物胁迫。这些结果表明，TaBI-1.1正向调节SA信号并在对生物胁迫的响应中起重要作用。此外，TaBI-1.1与水通道蛋白TaPIP1相互作用，并且它们都定位于ER膜（内质网膜）。此外，研究人员证明了SA处理后TaPIP1上调，并且TaPIP1转基因拟南芥增强了对Pst DC3000感染的抗性。由此表明，在ER膜上TaBI-1.1和TaPIP1之间的相互作用可能发生在对SA信号和防御反应的响应中。
材料和方法
材料
拟南芥Columbia-0（Col-0）作为TaBI-1.1过表达的背景， 突变体atbi1-2从拟南芥生物资源中心（ABRC）获得。 从栽培的小麦品种小白麦扩增TaBI-1.1和TaPIP1的cDNA， 将PCR产物克隆到pLB载体中。
RNA-Seq 分析数据来源：1.使用HiSeq 2500平台测序；2. SRA数据库下载（登录号：PRJNA289545）
方法
RNA-Seq 分析平台：百迈客云平台（BMKCloud）
其他实验方法：1.qRT-PCR分析；2.转基因拟南芥植株在胁迫处理下的应答及性状评价；3.β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）活性测定；4.细菌接种和细菌生长的监测；5.酵母双杂交；6.Pull-Down assay（免疫沉淀法）；7.亚细胞定位测定；8.ELISA Assay（酶联免疫吸附试验）。
分析结果
1.通过qRT-PCR和β-葡糖醛酸糖苷酶（GUS）染色确定TaBI-1.1的表达模式
首先分析Fg处理的小麦RNA-seq数据，从中分离出前10个差异表达基因。鉴定了两个小麦BI-1基因，在小麦Ensembl数据库中筛选出三种BI-1基因。根据氨基酸比对，TaBI-1.1与TaBI-1同一性达到99.19％。与对照相比，Fg处理对TaBI-1.1的表达水平上调24倍。使用qRT-PCR检测TaBI-1.1的表达模式：在响应SA处理时显着上调，在响应ABA处理时下调，响应NaCl处理，表达水平在4小时后下降，在2小时稍微增加并且在8小时后回到其初始水平（图1B）。
研究者构建了含有1.7kb TaBI-1.1启动子并生成转基因拟南芥的PBI :: GUS融合体，以研究TaBI-1.1的空间表达模式。使用GUS染色测定组织GUS活性。且通过qRT-PCR进一步证实GUS表达水平（图1H）。结果表明，TaBI-1.1在各种胁迫下均有表达。
图1. 通过qRT-PCR和GUS染色评估TaBI-1.1的相应表达模式
2.TaBI-1.1的表达增强了拟南芥对Pst DC3000感染的抗性
选择两个TaBI-1.1表达水平相对较高的纯合株系3和7（35S :: TaBI-1.1＃1和35S :: TaBI-1.1＃2）（图2A）。将atbi1-2，Col-0和两个转基因品系的四周龄叶子进行Pst DC3000感染或10mM MgCl 2处理（模拟物）。在模拟实验中，在用10mM MgCl 2处理3天后，在atbi1-2，Col-0和两个转基因品系的叶中没有观察到明显差异（图2B）。在用600nm（OD600）0.002的光密度接种Pst DC3000，3天后在这些叶中检测到疾病症状。 atbi1-2突变体表现出的症状较严重，因为几乎所有的叶片都表现出严重的萎黄和坏死，而两种转基因品系表现出比atbi1-2和Col-0更轻微的疾病症状。转基因植物的一小部分叶子是绿色的，没有表现出萎黄和坏死。 Col-0叶中疾病症状的程度介于atbi1-2和两个转基因品系之间（图2C）。
在Pst DC3000处理下，与Col-0相比，在两个转基因品系中检测到显着较高的SA水平，并且在四种基因型中35S :: TaBI-1.1＃1含有最高的SA水平。 Col-0和atbi1-2之间的差异也达到了显着水平（图2D）。在0和3dpi时测量 atbi1-2，Col-0和两个转基因品系的叶片中的细菌滴度。在初始接种量（0dpi）中，在四种基因型中没有观察到致病细菌生长的显着差异。在3dpi时，两种转基因品系的细菌滴度明显低于Col-0，Col-0的细菌滴度也明显低于atbi1-2，表明两种转基因品系对致病细菌的生长有较强的抑制作用（图2F）。
3.TaBI-1.1正向调节的SA相关基因表达
PR基因表达与SA积累和系统获得性抗性（SAR）有关。研究者进一步检测了常规条件下生长2周龄Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1＃1幼苗中SA相关基因的表达。与Col-0和atbi1-2相比，在35S :: TaBI-1.1中观察到PR1，PR5，ICS1和EDS1有显着高表达水平。 然而，在这些基因表达水平中Col-0和atbi1-2之间没有检测到显着差异（图3）。 与Col-0相比，35S :: TaBI-1.1中PR1和PR5的表达水平分别增加了约11倍和9倍。 PR2，ICS1和EDS1表达的倍数变化低于PR1和PR5表达的变化（图3）。因此，TaBI-1.1上调PR1，PR2，PR5，ICS1和EDS1基因的表达，表明 TaBI-1.1在SA信号传导中起正向调节作用。
图3. 通过qRT-PCR检测正常条件下生长的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB1-1.1 2周龄幼苗中5个SA相关基因的表达水平。
4.TaBI-1.1降低了SA和ABA的敏感性
将Col-0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1的4日龄幼苗置于含有不同浓度SA，NaCl和ABA的MS培养基中，以研究Col- 0，atbi1-2和35S :: TaBI-1.1转基因拟南芥植株在苗期响应SA和其他胁迫处理的不同表型。 13天后监测到形态学变化。在没有生长调节剂的MS培养基上（MS0），在任何两种基因型的Col-0，atbi1-2和两种35S :: TaBI-1.1转基因品系之间没有观察到显著差异的根长，侧根或鲜重（图4A，E-G）。在补充有30μMSA的MS培养基上，atbi1-2与Col-0在鲜重，根长和侧根数量上显示出较大的差异（图4H-J）。 35S :: TaBI-1.1＃2的侧根数也与Col-0的侧根数显着不同（图4J）。在含有30μMSA的MS培养基上生长的植物中，Col-0的异常生长程度介于atbi1-2和35S :: TaBI-1.1之间（图4H-J）。高浓度SA会增加H2O2的积累并导致氧化损伤。当置于含有50μMSA的MS培养基上时，幼苗显示更明显的生长畸形。这些结果显示，在SA浓度较高的情况下，幼苗遭受更严重的SA胁迫。用高浓度SA处理的叶子比用MS0培养基处理的叶子绿色浅，黄色淡和叶子小（图4B）。在含有50μMSA的MS培养基上生长的35S :: TaB1-1.1＃1的根长显着长于Col-0（图4K）。35S :: TaBI-1.1＃1的鲜重和侧根数与Col-0相比显着增加（图4L，M）。因此，SA不仅影响叶子的大小和颜色，而且影响根长，鲜重和侧根数。
研究人员对含有NaCl和ABA的MS培养基上生长的幼苗的表型进行观察。结果显示atbi1-2对ABA更敏感（图4T-V），TaBI-1.1转基因拟南芥对高浓度SA表现出较低的敏感性（图4W-Y），并且atbi1-2突变体对ABA表现出增加的敏感性。
图4. 在含有SA，NaCl或ABA的MS培养基上生长的atbi1-2，Col-0和35S :: TaB-1.1幼苗根长，鲜重和侧根数的统计分析。
TaBI-1.1在发芽过程中对ABA的敏感性实验结果显示。含有0.5μMABA的培养基中，两种转基因株系萌发显着快于Col-0和atbi1-2（图5B）。 在含有1μMABA的培养基上观察不到显着差异（图5C）。 在含有2μMABA的培养基上，Col-0和两种转基因品系也比atbi1-2稍快地萌发（图5D）。 以上结果表明，TaBI-1.1转基因拟南芥对ABA的敏感性较低。
图5. TaBI-1.1转基因拟南芥在萌发过程中对ABA的敏感性降低。
5.拟南芥RNA-Seq分析中TaBI-1.1的表达
研究人员对35S :: TaBI-1.1＃1和Col-0植物进行了RNA-seq分析，以更好地理解TaBI-1.1功能。鉴定出48个上调基因和58个下调基因并做了一个热图。使用GO分析将差异表达的基因功能分类。富集了30多个GO terms，如图6所示。对于上调的基因，富集的GO terms主要集中在抗生物胁迫，细胞免疫应答和SA合成与代谢相关的生物过程上。前10个关键的Go terms分别是防御反应、对外部刺激的反应、对生物刺激的反应、对外部生物刺激的反应、多生物体过程、对另一个生物体的反应、对另一个生物体的防御反应、对压力的反应、单一生物体代谢过程和对化学物质的反应（图6A）。对于下调的基因，富集的GO terms集中在细胞组分上，并且前三项是细胞组分，膜和细胞周围（图6B）。选择七个上调基因和三个下调基因进行qRT-PCR实验，结果表明，qRT-PCR结果与RNA-seq分析一致。
图6. 使用RNA-seq分析GO terms在35S :: TaBI-1.1和Col-0之间差异表达的基因的富集
KEGG富集分析中观察到，上调基因富集了20多个KEGG通路。上调基因的前20个富集通路中，其中光合作用是最明显的富集途径（图7A）。 光合作用的富集因子达到0.09，而q值大约为0。相反，下调基因的KEGG富集通路并不明显，只有6个富集因子较低的通路被鉴定出来（图7B）。因此，TaBI-1.1参与对生物胁迫的应答并主要通过基因上调表达来执行其防御功能。
图7. 35S :: TaBI-1.1和Col-0差异表达基因的KEGG富集分析
6.TaBI-1.1与TaPIP1相互作用并在ER膜上与TaPIP1共定位
将TaBI-1.1置于PGBKT7（BD）载体中，通过酵母双杂交实验鉴定出一个候选的相互作用物质，水通道蛋白TaPIP1。 并且通过酵母双杂交和pull-down测定确定TaBI-1.1和TaPIP1之间在体内和体外的相互作用，且共定位于ER膜。
通过qRT-PCR检测响应多次处理的TaPIP1的表达水平。 SA，NaCl和ABA处理使TaPIP1表达上调，这意味着TaPIP1可能参与对生物和非生物胁迫的反应（图8D）。
图8. TaBI-1.1和TaPIP1的相互作用和亚细胞定位
7.TaPIP1增加了拟南芥对PstDC3000感染的抗性
为了进一步研究TaBI-1.1和TaPIP1之间相互作用的潜在功能，研究人员构建了一个在 CaMV 35S启动子控制下表达TaPIP1的转基因拟南芥。研究者在Pst DC3000感染下检测了TaPIP1转基因拟南芥的叶表型。在模拟处理下，Col-0和两个转基因品系的叶片中没有观察到差异（图9B）。在用Pst DC3000接种后，发现Col-0叶片上明显的褪绿症状，相反，两种转基因植物的褪绿症状较轻（图9C）。为了进一步证实TaPIP1转基因拟南芥中的抗性增加，在0和3dpi测量叶片中的细菌滴度。如图9D所示，在初始接种量中Col-0和两个转基因品系之间没有显着差异，但是在3dpi时两个TaPIP1转基因拟南芥中的细菌滴度显着低于Col-0，表明TaPIP1转基因拟南芥中病原菌的生长受到很大抑制。因此，TaBI-1.1和TaPIP1在响应Pst DC3000感染时表现出类似的作用，并且研究者推测TaBI-1.1和TaPIP1之间的相互作用可能涉及防御反应。
图9. TaPIP1转基因拟南芥对Pst DC3000表现出增强的抗性
创新点
BI-1是一种局限于内质网（ER）膜的细胞保护蛋白，在对生物和非生物胁迫的应答中发挥重要作用。迄今为止，虽然已经鉴定了几种与BI-1相互作用的蛋白质。然而，关于BI-1在内质网应激中机制的认知非常有限，BI-1调节植物内质网应激反应的机制目前尚不清楚，该研究中，通过整合利用公共数据中禾谷镰刀菌（Fg）处理的小麦的RNA-seq数据分析确定了小麦BI-1基因TaBI-1.1，揭示了TaBI-1.1和TaPIP1在响应病原体感染的ER膜上的相互作用的可能作用，为后续的研究做了较好的铺垫。
参考文献：
Lu P P, Yu T F, Zheng W J, et al. The Wheat Bax Inhibitor-1 Protein Interacts with an Aquaporin TaPIP1 and Enhances Disease Resistance in Arabidopsis[J]. Front Plant Sci, 2018, 9:20.